2) одновременной регистрацией изображения со всех светофильтров, подобранных для использованных при мечении ДНК-зондов флуорохромов
3) с использованием для одномоментной регистрации изображения светофильтра с широкой полосой пропускания флуоресценции от ДНК-зондов
4) последовательной регистрацией изображений с использованием набора из 24 светофильтров с полосами пропускания флуоресценции, специфичными комбинациям флуорохромов, использованных для мечения хромосомных ДНК-библиотек
При многоцветной FISH-методике ДНК-зонды метят различными флуорохромами или их комбинациями. После гибридизации каждый флуорохром возбуждают и регистрируют в соответствующем спектральном диапазоне с помощью фильтров, выделяющих его эмиссионный сигнал. Поэтому изображения получают последовательно для каждого используемого набора фильтров, а затем совмещают программно в единое многоканальное изображение.
Такой подход необходим из-за перекрывания спектров флуоресценции: сигнал одного флуорохрома может частично попадать в диапазон регистрации другого. Раздельная регистрация каналов позволяет определить интенсивность каждого компонента и установить индивидуальную цветовую комбинацию хромосомы или участка ДНК. При M-FISH (multicolor FISH) эта комбинация формирует спектральный код хромосомы, благодаря чему выявляются числовые и структурные перестройки, включая транслокации и маркерные хромосомы.
Одновременная регистрация через широкополосный фильтр приводит к смешению флуоресцентных сигналов и снижает точность их идентификации. Указание фиксированного набора из 24 фильтров также некорректно: число фильтров зависит от применяемой аппаратуры и схемы флуорохромного кодирования, тогда как 24 обычно соответствует числу распознаваемых хромосомных классов или комбинаций, а не универсальному комплекту фильтров.
| Компонент метода | Принцип | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| ДНК-зонды | Комплементарно связываются с определёнными последовательностями хромосомной ДНК | Определяют локализацию исследуемого участка или принадлежность сигнала хромосоме |
| Флуорохромы | Испускают свет в характерном спектральном диапазоне после возбуждения | Обеспечивают различение нескольких зондов в одном препарате |
| Набор светофильтров | Выделяет возбуждающее и эмиссионное излучение конкретного флуорохрома | Позволяет получить независимый канал регистрации каждого спектрального компонента |
| Последовательная регистрация | Изображение последовательно снимают через разные фильтры с последующим совмещением каналов | Снижает спектральное перекрывание и повышает точность классификации сигналов |
| Комбинаторное мечение | Одной хромосоме соответствует уникальная комбинация флуорохромов | Позволяет распознавать хромосомы и обнаруживать обмен участками между ними |
| Широкополосный фильтр | Пропускает одновременно несколько диапазонов эмиссии | Даёт смешанный сигнал и не обеспечивает надёжного разделения флуорохромов |
| Цифровая обработка | Каналы объединяют, нормируют и сопоставляют с эталонными спектральными профилями | Формирует цветовую карту хромосом и облегчает выявление аномалий кариотипа |
Ключевым диагностическим принципом является разделение флуоресцентных каналов до их компьютерного объединения. Это обеспечивает достоверное распознавание индивидуальных спектральных профилей хромосом. Метод особенно полезен при сложных перестройках, когда стандартное кариотипирование или двухцветная FISH не позволяют установить происхождение хромосомного материала. Интерпретация результатов должна учитывать контрольные препараты, качество гибридизации и возможное спектральное перекрывание сигналов.