2) ДНК+РНК
3) тотальную ДНК
4) белковую фракцию
Для оценки экспрессии гена исследуют уровень его транскрипта, то есть специфической молекулы РНК, образующейся в результате транскрипции. Поэтому из биоматериала выделяют тотальную РНК, которая содержит матричную РНК (мРНК), рибосомальную, транспортную и другие некодирующие РНК. Наличие в тотальной РНК транскриптов исследуемого гена позволяет определить их относительное или абсолютное количество и судить об активности гена в конкретной ткани или клеточной популяции.
В большинстве методов анализа экспрессии, включая ОТ-ПЦР и ОТ-кПЦР, выделенную РНК сначала подвергают обратной транскрипции с образованием комплементарной ДНК (кДНК), после чего проводят амплификацию и количественную регистрацию продукта. При RNA-seq из РНК формируют секвенирующую библиотеку и определяют транскриптомный профиль образца. Качество результата зависит от целостности РНК, отсутствия деградации и примеси геномной ДНК; при необходимости применяют обработку ДНКазой и используют референсные гены для нормализации.
Выделение ДНК позволяет оценивать генотип, мутации, делеции, амплификации и число копий гена, но само по себе не отражает его текущую транскрипционную активность. Белковая фракция характеризует конечный продукт экспрессии, однако содержание белка может изменяться независимо от количества мРНК вследствие посттранскрипционной регуляции, различий в трансляции и скорости деградации белка. Смесь ДНК и РНК не является оптимальным исходным материалом для стандартного анализа экспрессии и может повышать риск ингибирования или неспецифической амплификации.
| Исследуемый материал | Что преимущественно оценивается | Типичные методы | Диагностическая интерпретация |
|---|---|---|---|
| Тотальная РНК | Уровень транскриптов, включая мРНК и некодирующие РНК | ОТ-кПЦР, RNA-seq, микрочиповый анализ | Основной материал для оценки транскрипционной активности гена |
| Обогащённая мРНК | Профиль кодирующих транскриптов | Селекция полиаденилированной РНК, транскриптомное секвенирование | Повышает долю информативных мРНК, но может снижать представительство отдельных некодирующих и частично разрушенных транскриптов |
| Геномная ДНК | Последовательность и структура гена | ПЦР, MLPA, секвенирование, сравнительная геномная гибридизация | Выявляет мутации, делеции, дупликации и изменения числа копий, но не уровень экспрессии |
| Смесь ДНК и РНК | Неоднородный набор нуклеиновых кислот | Не является стандартным материалом для количественного анализа экспрессии | Может приводить к неспецифическим сигналам и требует раздельной очистки или удаления ДНК |
| Белковая фракция | Количество или активность белкового продукта | Вестерн-блоттинг, ИФА, масс-спектрометрия | Отражает посттранскрипционный уровень регуляции и не заменяет анализ транскрипта |
| Комплементарная ДНК | Репрезентация РНК-транскриптов после обратной транскрипции | ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ампликонное секвенирование | Используется как производный шаблон для количественного или качественного анализа экспрессии |
Количественный результат обычно выражают относительно референсных генов или в абсолютных копиях транскрипта. Для корректного сравнения образцов необходимо стандартизировать этапы взятия материала, выделения РНК и обратной транскрипции. Интерпретация экспрессии должна учитывать тип ткани, клеточный состав образца и физиологическое или патологическое состояние пациента. Изменение уровня мРНК не всегда сопровождается пропорциональным изменением количества функционального белка.