2) характерно использование двух пар праймеров
3) характерно построение ДНК по матрице мРНК (+)
4) характерно использование флуоресцентно меченых реагентов
Правильным является положение о синтезе ДНК по матрице мРНК. На первом этапе реакции фермент обратная транскриптаза использует молекулу матричной РНК и синтезирует комплементарную ДНК (кДНК). Полученная кДНК служит матрицей для последующей амплификации специфического участка методом ПЦР, что позволяет выявлять экспрессию генов, РНК-содержащие вирусы и транскрипты fusion-генов.
Обратная транскрипция является обязательной отличительной стадией данного метода, поскольку стандартная ДНК-полимераза непосредственно не амплифицирует РНК. Использование двух пар праймеров характерно преимущественно для гнездовой ПЦР, а не для любой ПЦР с обратной транскрипцией. Электрофорез может применяться при анализе продуктов конечной ПЦР, поэтому его исключение не является универсальным признаком. Флуоресцентно меченые зонды или красители обязательны главным образом для количественной ПЦР в реальном времени, но не для классического варианта метода.
В диагностике сначала получают кДНК из РНК исследуемого образца, затем амплифицируют выбранный фрагмент и оценивают наличие или количество продукта. Для контроля специфичности используют отрицательный контроль и контроль без этапа обратной транскрипции, позволяющий исключить амплификацию загрязняющей геномной ДНК.
| Метод или этап | Исходная матрица | Ключевой принцип | Основной результат |
|---|---|---|---|
| Обратная транскрипция | мРНК или другая РНК | Синтез комплементарной ДНК с помощью обратной транскриптазы | Получение кДНК для дальнейшей амплификации |
| Классическая ПЦР | ДНК, включая кДНК | Циклическая денатурация, отжиг праймеров и элонгация | Накопление специфического ампликона |
| ПЦР с обратной транскрипцией | РНК через промежуточную кДНК | Последовательное сочетание обратной транскрипции и ПЦР | Качественное выявление РНК-мишени или транскрипта |
| Количественная RT-PCR в реальном времени | РНК через кДНК | Регистрация флуоресценции в каждом цикле амплификации | Оценка исходного количества РНК по значению Ct |
| Гнездовая ПЦР | ДНК или кДНК | Два последовательных раунда амплификации с двумя парами праймеров | Повышение аналитической чувствительности и специфичности |
| Электрофоретический анализ | Продукты конечной ПЦР | Разделение фрагментов ДНК по размеру в агарозном или полиакриламидном геле | Визуализация ампликона и проверка его размера |
Таким образом, ключевая особенность метода заключается в переводе РНК-информации в стабильную ДНК-копию перед амплификацией. Это делает возможным исследование транскрипционной активности генов и обнаружение РНК-геномов. Наличие флуоресценции, двух пар праймеров или электрофоретического этапа зависит от конкретной модификации методики и не определяет RT-PCR в целом.