2) ДНК-лигаза (+)
3) эндонуклеаза
4) рестриктаза
ДНК-лигаза катализирует завершающий этап синтеза отстающей цепи ДНК — соединение фрагментов Оказаки в непрерывную полинуклеотидную цепь. После удаления РНК-праймера и заполнения образовавшегося промежутка между соседними фрагментами сохраняется разрыв (ник ) в сахарофосфатном остове. Лигаза соединяет 3′-гидроксильную группу одного фрагмента с 5′-фосфатной группой другого, формируя прочную 3′–5′-фосфодиэфирную связь.
Фрагменты Оказаки образуются на отстающей цепи, поскольку ДНК-полимеразы способны удлинять ДНК только в направлении 5′→3′. В прокариотической клетке ДНК-полимераза III синтезирует основную часть фрагментов, а ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймеры и замещает их ДНК. Однако именно ДНК-лигаза устраняет оставшиеся разрывы между участками, превращая их в единую цепь.
Эндонуклеазы расщепляют фосфодиэфирные связи внутри полинуклеотидной цепи, а рестриктазы являются разновидностью эндонуклеаз, узнающих специфические последовательности ДНК. Поэтому они участвуют в разрезании или переработке нуклеиновой кислоты, но не в физиологическом соединении фрагментов репликации.
| Фермент | Основная функция | Роль при синтезе отстающей цепи | Итог реакции |
|---|---|---|---|
| ДНК-лигаза | Соединение соседних участков ДНК | Устраняет ники между фрагментами Оказаки после замены праймеров | Образование 3′–5′-фосфодиэфирной связи |
| ДНК-полимераза III | Синтез новой цепи ДНК | Удлиняет каждый фрагмент Оказаки от РНК-праймера | Формирование участков дочерней ДНК |
| ДНК-полимераза I | Удаление праймеров и заполнение промежутков ДНК | Замещает РНК-праймеры ДНК-нуклеотидами у прокариот | Заполненный промежуток, но возможный сохраняющийся ник |
| Эндонуклеаза | Гидролитическое расщепление внутренних фосфодиэфирных связей | Не соединяет фрагменты репликации | Разрыв полинуклеотидной цепи |
| Рестриктаза | Специфическое расщепление ДНК в участках узнавания | В репликации фрагментов Оказаки не участвует | Получение фрагментов ДНК с определёнными концами |
Активность ДНК-лигазы требует энергетической активации 5′-фосфатного конца; в разных организмах для этого используются АТФ или НАД+. В эукариотических клетках удаление праймеров обеспечивают преимущественно RNase H и FEN1, после чего разрывы также закрываются ДНК-лигазой. Нарушение лигирования приводит к накоплению одноцепочечных разрывов и снижению стабильности реплицируемой ДНК. Таким образом, ключевой признак правильного ответа — способность фермента не синтезировать или расщеплять ДНК, а непосредственно запечатывать разрыв между уже синтезированными фрагментами.