2) инсулин
3) ЭДТА
4) гепарин (+)
Гепарин является выраженным ингибитором полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это высокосульфатированный полисахарид с сильным отрицательным зарядом, который взаимодействует с ДНК-полимеразой, матричной ДНК и компонентами реакционной смеси. В результате снижается активность термостабильной полимеразы, нарушаются отжиг праймеров и элонгация, что приводит к ослаблению или полному отсутствию амплификации.
Наиболее часто проблема возникает при исследовании крови, взятой в пробирки с гепарином, а также при переносе его следовых количеств после выделения нуклеиновых кислот. Поэтому для молекулярно-генетических исследований обычно используют кровь с ЭДТА, а не с гепарином. При необходимости гепариновую контаминацию устраняют дополнительной очисткой экстракта или применением гепариназы; при этом важно контролировать потери ДНК и наличие внутренних контролей амплификации.
ЭДТА также способна подавлять ПЦР при избыточной концентрации, поскольку связывает ионы магния, необходимые для работы ДНК-полимеразы, однако в стандартных условиях после выделения ДНК ее влияние обычно контролируемо. Гирудин блокирует тромбин, но не относится к типичным ингибиторам ДНК-полимеразы, а инсулин не оказывает характерного ингибирующего действия на ПЦР.
| Компонент | Основное назначение или источник | Влияние на ПЦР | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Гепарин | Антикоагулянт для получения плазмы | Выраженное ингибирование ДНК-полимеразы и амплификации | Непредпочтителен для ПЦР; возможны ложноотрицательные результаты |
| ЭДТА | Антикоагулянт, связывающий двухвалентные катионы | Может снижать активность полимеразы при избытке вследствие хелатирования Mg2+ | Обычно является предпочтительным антикоагулянтом для молекулярно-генетических исследований |
| Цитрат натрия | Антикоагулянт, применяемый преимущественно в коагулологии | Обычно оказывает небольшое прямое ингибирующее действие; возможен эффект разведения | Допустимость зависит от методики и соотношения крови с антикоагулянтом |
| Гирудин | Прямой ингибитор тромбина | Не считается типичным ингибитором ПЦР | Антикоагулянтный механизм не означает автоматического подавления амплификации |
| Гемоглобин | Компонент эритроцитов, попадающий в экстракт при гемолизе | Может подавлять активность полимеразы и изменять флуоресцентный сигнал | Особенно значим для цельной крови и недостаточно очищенных экстрактов |
| Иммуноглобулины | Белки плазмы и сыворотки | При высокой концентрации способны связывать нуклеиновые кислоты или компоненты реакции | Удаляются на этапах эффективной пробоподготовки |
| Фенол и остаточный этанол | Реагенты или загрязнители после выделения ДНК | Нарушают работу ферментов и снижают эффективность амплификации | Требуют дополнительной очистки или полного высушивания экстракта |
Ингибирующее действие гепарина следует учитывать при интерпретации отрицательного результата ПЦР из крови. Для выявления ингибирования применяют внутренний контроль амплификации: его отсутствие или выраженное снижение сигнала указывает на проблему реакции, а не обязательно на отсутствие исследуемой мишени. Выбор антикоагулянта, качество выделения ДНК и контроль чистоты экстракта являются обязательными этапами преаналитического обеспечения молекулярно-генетического исследования.