2) RT-PCR (+)
3) TALEN
4) ZFN
Правильный ответ — RT-PCR, поскольку это метод амплификации нуклеиновых кислот, а не технология направленного изменения последовательности ДНК. При обратной транскрипции РНК преобразуется в комплементарную ДНК, после чего выбранный фрагмент многократно копируется с помощью полимеразы и праймеров. Метод применяют для выявления РНК-содержащих вирусов, анализа экспрессии генов и контроля результатов экспериментов, однако сам по себе он не вносит мутации и не изменяет геном клетки.
К инструментам редактирования генома относят системы, способные распознавать заданный участок ДНК и инициировать его целенаправленное расщепление либо непосредственно изменять нуклеотидную последовательность. В системе CRISPR/Cas участок определяется направляющей РНК, а нуклеаза Cas осуществляет разрыв ДНК. TALEN и ZFN используют искусственные ДНК-связывающие домены, соединённые с нуклеазным доменом FokI; для эффективного расщепления ДНК обычно требуется сближение двух молекул.
После образования двунитевого разрыва клеточные механизмы репарации могут привести к инактивации гена за счёт небольших вставок или делеций либо обеспечить точную замену последовательности при наличии матрицы для гомологичной рекомбинации. Таким образом, принципиальное отличие редакторов генома от RT-PCR заключается в изменении генетического материала, тогда как RT-PCR только выявляет или количественно оценивает уже существующие нуклеиновые кислоты.
| Подход | Мишень и принцип распознавания | Каталитический компонент | Изменение генома | Основное назначение |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR/Cas | Заданная последовательность ДНК определяется комплементарностью направляющей РНК | Нуклеаза Cas, например Cas9 или Cas12 | Целенаправленный разрыв ДНК; возможны делеции, вставки, замены, а при использовании производных систем — редакторное изменение оснований | Нокаут генов, коррекция вариантов, функциональные исследования |
| TALEN | Мишень распознаётся модульными повторами TALE, каждый из которых связывает определённый нуклеотид | Домен нуклеазы FokI | Двунитевой разрыв при димеризации двух FokI-содержащих молекул | Высокоспецифичное редактирование выбранного локуса |
| ZFN | Цинковые пальцы распознают короткие участки ДНК и объединяются в модульный ДНК-связывающий домен | Домен нуклеазы FokI | Индуцированный двунитевой разрыв с последующей репарацией | Генное выключение и направленная модификация ДНК |
| RT-PCR | Праймеры комплементарны исследуемой последовательности РНК или полученной с неё кДНК | Обратная транскриптаза и термостабильная ДНК-полимераза | Изменения генома не вызывает; происходит амплификация диагностического фрагмента | Обнаружение РНК, исследование экспрессии генов, диагностика РНК-вирусных инфекций |
| Тип результата | Для редакторов — модифицированный локус; для RT-PCR — амплифицированный продукт и сигнал его обнаружения | Редакторы изменяют генетическую последовательность, RT-PCR только регистрирует её наличие или количество | Функциональное редактирование против лабораторной детекции | |
| Ключевой критерий отнесения к редактированию | Наличие направленного воздействия на ДНК с последующим изменением её последовательности | Целенаправленная модификация генома | Отсутствие такого воздействия у RT-PCR исключает её из данной группы | |
RT-PCR может использоваться совместно с редактированием генома для оценки уровня транскриптов или проверки экспрессии целевого гена. Однако диагностическая регистрация нуклеиновой кислоты не равнозначна её модификации. При классификации лабораторных технологий необходимо различать методы анализа генетического материала и инструменты его целенаправленного редактирования.