2) секвенировании по Сенгеру (+)
3) саузерн-блот
4) ПЦР_ПДФР
Капиллярный электрофорез является основным этапом автоматизированного секвенирования по Сэнгеру. При этом методе ДНК-полимераза синтезирует комплементарную цепь в присутствии обычных дезоксирибонуклеотидов и флуоресцентно меченных дидезоксирибонуклеотидов. Включение дидезоксирибонуклеотида прекращает элонгацию цепи, поэтому образуется набор фрагментов разной длины, каждый из которых заканчивается определённым нуклеотидом.
Полученные фрагменты разделяются в полимерном геле внутри тонкого капилляра: короткие фрагменты мигрируют быстрее длинных. При прохождении через зону лазерной детекции регистрируется флуоресценция терминального нуклеотида, после чего компьютер формирует электрофореграмму последовательности. Таким образом, капиллярный электрофорез обеспечивает разделение и считывание продуктов реакции Сэнгера с разрешением, достаточным для идентификации последовательности ДНК и точечных вариантов.
В ПЦР в реальном времени результат получают по изменению флуоресценции в ходе амплификации, без обязательного разделения продуктов по длине. Саузерн-блот включает электрофорез, перенос ДНК на мембрану и гибридизацию с зондом, обычно с использованием агарозного геля. ПЦР-ПДРФ основана на рестрикционном расщеплении ампликона и сравнении размеров фрагментов, чаще всего после электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.
| Метод | Основной аналитический сигнал | Роль электрофореза | Типичный результат |
|---|---|---|---|
| Секвенирование по Сэнгеру | Флуоресценция терминальных дидезоксинуклеотидов | Разделение одноцепочечных фрагментов по длине в капилляре | Электрофореграмма с последовательностью нуклеотидов и пиками вариантов |
| ПЦР в реальном времени | Накопление флуоресценции во время амплификации | Как правило, не используется для разделения ампликонов | Кривые амплификации, пороговый цикл, количественная оценка мишени |
| Саузерн-блот | Гибридизация мембранного зонда с комплементарной ДНК | Первичное разделение проводят в геле, затем ДНК переносят на мембрану | Полосы гибридизации определённого размера |
| ПЦР-ПДРФ | Наличие или отсутствие сайтов рестрикции | Разделение рестрикционных фрагментов обычно в агарозном геле | Профиль полос, соответствующий генотипу или аллелю |
| Фрагментный анализ | Флуоресцентная метка и длина амплифицированного фрагмента | Капиллярное разделение фрагментов с высокой точностью | Определение размеров STR, инсерций, делеций или продуктов MLPA |
Для интерпретации результатов Сэнгера оценивают качество электрофореграммы, равномерность пиков и наличие фонового сигнала. Гетерозиготная замена обычно проявляется двумя перекрывающимися пиками в одной позиции, тогда как гомозиготный вариант представлен преобладающим единичным сигналом. Метод особенно эффективен для подтверждения заранее предполагаемых вариантов в отдельных экзонах, но менее пригоден для одновременного анализа большого числа генов. При выявлении варианта результат сопоставляют с референсной последовательностью и описывают по стандартной номенклатуре HGVS.