2) 35-40 (+)
3) 25-34
4) 15-24
При конечной ПЦР амплификация целевого фрагмента происходит в каждом цикле по схеме денатурация — отжиг праймеров — элонгация . При идеальных условиях количество ампликона удваивается за цикл, поэтому даже небольшое исходное число копий матрицы после многократного повторения реакции превращается в количество, достаточное для визуализации в агарозном геле. На практике эффективность удвоения ниже 100%, а после исчерпания праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов и снижения активности полимеразы реакция выходит на плато.
Для обнаружения продукта методом электрофореза в агарозном геле требуется накопить массу ампликона, превышающую предел чувствительности окрашивания и регистрации полосы. В стандартных протоколах endpoint-ПЦР это обычно достигается примерно за 35–40 циклов, особенно при низкой концентрации исходной ДНК, малом числе копий мишени или исследовании клинического материала. Поэтому указанный диапазон является правильным для учебной оценки достаточного числа циклов, обеспечивающего детекцию целевого продукта.
Меньшее число циклов может привести к отсутствию видимой полосы при сохранении истинно положительного результата, поскольку количество ампликона еще недостаточно для визуализации. Чрезмерное увеличение числа циклов не всегда повышает аналитическую ценность реакции: возрастает риск неспецифической амплификации, образования праймер-димеров и контаминации ампликоном. Интерпретация результата должна учитывать положительный и отрицательный контроли, размер ожидаемого фрагмента и отсутствие неспецифических полос.
| Число циклов | Ожидаемый уровень амплификации | Интерпретация полосы в агарозном геле | Основные особенности |
|---|---|---|---|
| 10–15 | Низкий | Полоса обычно не визуализируется | Обнаружение возможно лишь при высокой исходной концентрации матрицы и очень эффективной реакции |
| 15–24 | Недостаточный или пограничный | Чаще отсутствует либо имеет слабую интенсивность | Вероятен ложноотрицательный результат при низкой вирусной, бактериальной или клеточной нагрузке |
| 25–34 | Умеренный | Полоса может быть видимой | Результат зависит от количества исходной ДНК, эффективности праймеров, длины ампликона и чувствительности окрашивания |
| 35–40 | Высокий, обычно достаточный для endpoint-ПЦР | Ожидается отчетливая полоса соответствующего размера | Стандартный диапазон для детекции низкокопийной мишени в агарозном геле |
| Более 40 | Фаза плато | Возможна полоса, но ее специфичность снижается | Увеличивается вероятность неспецифических продуктов, праймер-димеров и амплификационной контаминации |
| Отрицательный контроль | Амплификация отсутствует | Полоса целевого продукта не должна определяться | Появление полосы указывает на контаминацию реагентов или нарушение организации ПЦР |
Таким образом, диапазон 35–40 циклов обеспечивает накопление ампликона до уровня, доступного визуальному выявлению в агарозном геле. Число циклов не является универсальной константой и оптимизируется с учетом матрицы, праймеров и аналитической чувствительности методики. Окончательная оценка выполняется только при соответствии полосы расчетному размеру и корректных результатах контролей.