2) идентификации точек разрыва
3) выявления сложных структурных перестроек (+)
4) выявления точечных мутаций
M-FISH (multicolor fluorescence in situ hybridization) — многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ с использованием наборов ДНК-зондов, специфичных для целых хромосом. За счёт комбинации флуорохромов каждой хромосоме присваивается определённый цвет, поэтому на метафазной пластинке можно установить происхождение отдельных участков производных хромосом. Это особенно важно при перестройках, в которых участвуют несколько хромосом и формируются сложные производные структуры.
Метод применяют для выявления сложных структурных перестроек, включая многокомпонентные транслокации, инсерции, маркерные хромосомы и перестройки с участием трёх и более хромосом или нескольких точек разрыва. M-FISH позволяет определить, какие хромосомные материалы входят в состав аномальной структуры, однако не устанавливает точную нуклеотидную последовательность или координаты точки разрыва. Для анализа точечных мутаций используют молекулярно-генетические методы, а для детального картирования разрывов — локус-специфическую FISH, микроматричный анализ или секвенирование.
| Метод | Основной объект исследования | Диагностическая задача | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| M-FISH | Материал целых хромосом на метафазной пластинке | Выявление сложных и многохромосомных структурных перестроек, определение происхождения сегментов производных хромосом | Ограниченное разрешение; точные молекулярные границы разрывов не определяет |
| Стандартное кариотипирование | Морфология и число хромосом | Обнаружение крупных числовых аномалий и видимых структурных изменений | Недостаточная точность при сложных или субмикроскопических перестройках |
| Локус-специфическая FISH | Определённый ген или хромосомный локус | Подтверждение конкретной делеции, амплификации или транслокации; уточнение расположения исследуемого участка | Требует заранее сформулированной гипотезы и набора соответствующих зондов |
| Хромосомный микроматричный анализ | Изменения числа копий ДНК по всему геному | Выявление микроделеций, микродупликаций и геномного дисбаланса | Обычно не выявляет сбалансированные транслокации и инверсии |
| ПЦР и секвенирование | Нуклеотидная последовательность ДНК | Диагностика точечных вариантов, малых инделов и отдельных молекулярных точек разрыва | Не предназначены для первичной оценки общей структуры хромосомного набора |
| Анализ интерфазных ядер | Хромосомные сигналы в неделящихся клетках | Быстрое подтверждение заранее известной аномалии и оценка мозаицизма при использовании подходящих зондов | M-FISH преимущественно применяют на метафазных хромосомах; универсальный скрининг мозаицизма этим методом ограничен |
Практическая ценность M-FISH состоит в повышении точности цитогенетической интерпретации при необычном или нерасшифрованном кариотипе. Результат метода следует сопоставлять с данными стандартного кариотипирования, клиническими проявлениями и, при необходимости, молекулярными исследованиями. При подозрении на мозаицизм оценивают достаточное число клеток и выбирают метод, чувствительный к предполагаемому уровню патологического клона. При обнаружении сложной перестройки для определения её функциональных последствий дополнительно исследуют дисбаланс генетического материала и вовлечённые гены.