2) блоттинг-гибридизация
3) секвенирование
4) полимеразная цепная реакция (+)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод специфической амплификации, то есть многократного увеличения числа копий выбранного участка ДНК. Реакция проводится с использованием матричной ДНК, двух праймеров, комплементарных границам анализируемого фрагмента, дезоксирибонуклеотидов и термостабильной ДНК-полимеразы. При повторяющихся циклах денатурации, отжига праймеров и элонгации количество целевых молекул теоретически возрастает экспоненциально.
Специфичность ПЦР определяется последовательностью праймеров и условиями отжига, поэтому метод позволяет выявлять конкретные мутации, патогенные микроорганизмы, хромосомные перестройки или аллели генов даже при их крайне низком содержании в образце. Для исследования РНК применяют предварительную обратную транскрипцию с последующей ПЦР; такой вариант называют ОТ-ПЦР или RT-PCR. При количественной ПЦР (ПЦР в реальном времени) накопление продукта регистрируется по флуоресцентному сигналу, что позволяет оценивать исходное количество нуклеиновой кислоты.
Остальные перечисленные методы не предназначены непосредственно для амплификации заданного фрагмента. Электрофорез разделяет молекулы по размеру и заряду, блоттинг-гибридизация выявляет нужную последовательность после переноса на мембрану, а секвенирование устанавливает порядок нуклеотидов. Поэтому именно ПЦР соответствует принципу увеличения концентрации определённого фрагмента ДНК в биологическом материале.
| Метод | Основной принцип | Что получают в результате | Амплификация целевой ДНК |
|---|---|---|---|
| ПЦР | Циклическое копирование участка ДНК между двумя специфическими праймерами термостабильной ДНК-полимеразой | Многократное увеличение числа копий выбранного фрагмента и его выявление | Да, экспоненциальная |
| ПЦР в реальном времени | Амплификация с одновременной регистрацией флуоресцентного сигнала | Качественное выявление и количественная оценка исходной концентрации нуклеиновой кислоты | Да |
| Электрофорез | Разделение фрагментов нуклеиновых кислот в электрическом поле преимущественно по размеру | Электрофоретический профиль и оценка длины фрагментов | Нет |
| Блоттинг-гибридизация | Перенос разделённых фрагментов на мембрану и их обнаружение меченым комплементарным зондом | Подтверждение наличия последовательности, соответствующей зонду | Нет, за исключением предварительной ПЦР-амплификации |
| Секвенирование | Определение последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте | Нуклеотидная последовательность и выявление вариантов генома | Не является основной целью метода |
Надёжность ПЦР зависит от качества выделения нуклеиновой кислоты, правильного подбора праймеров и строгого контроля контаминации. В лабораторной диагностике используют отрицательный контроль, положительный контроль и внутренний контроль реакции, позволяющий выявлять ингибирование амплификации. Результат ПЦР интерпретируют с учётом клинических данных, аналитической чувствительности метода и возможности обнаружения как жизнеспособного, так и уже неактивного возбудителя.