2) на использовании высокоплотных ДНК-микроматриц
3) на использовании рестрикционного фрагментирования ДНК-библиотек
4) на построении динамического референсного интервала, в пределах которого отклонение гибридизационного профиля, является нормальным (+)
Медицински корректный принцип HR-CGH — применение высокоплотных ДНК-микроматриц, то есть вариант 2. На микроматрице размещены многочисленные иммобилизованные ДНК-зонды, распределённые по всему геному. ДНК исследуемого образца и контрольного образца помечают различными флуорофорами, смешивают и конкурентно гибридизуют с зондами. Соотношение интенсивности сигналов отражает относительное содержание соответствующих участков генома.
Высокая разрешающая способность метода определяется плотностью и размером интервала между зондами: чем больше зондов приходится на единицу генома, тем меньшие делеции и дупликации можно выявить. Результат обычно представляют как профиль отношения сигналов или значение log2 ratio: отклонение в отрицательную сторону указывает на потерю копий, в положительную — на приобретение генетического материала. Ультразвуковое и рестрикционное фрагментирование являются этапами подготовки библиотек для отдельных методов секвенирования и не составляют основу CGH.
Построение референсного интервала может использоваться при нормализации данных, контроле качества и интерпретации пограничных отклонений, однако не является фундаментальным принципом HR-CGH. Поэтому, если знак + в представленном задании действительно установлен у пункта 4, ключ нуждается в исправлении: правильным следует считать положение о высокоплотных ДНК-микроматрицах.
| Метод | Основной принцип | Что выявляет | Разрешающая способность | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|---|
| Классическая CGH | Конкурентная гибридизация ДНК пациента и контроля на метафазных хромосомах | Крупные потери и приобретения генетического материала | Ниже, чем у микроматричных вариантов | Не позволяет надёжно обнаруживать небольшие CNV |
| HR-CGH, или array-CGH | Конкурентная гибридизация на высокоплотной ДНК-микроматрице | Делеции, дупликации и другие вариации числа копий (CNV) | От десятков килобаз до меньших интервалов в зависимости от платформы | Не выявляет сбалансированные перестройки и большинство точечных вариантов |
| SNP-микроматрица | Анализ аллельного состава и интенсивности сигналов SNP-зондов | CNV, потери гетерозиготности, UPD и отдельные мозаичные изменения | Высокая | Требует интерпретации аллельных профилей; не предназначена для всех структурных вариантов |
| FISH | Гибридизация флуоресцентных зондов с выбранными локусами хромосом | Целевые делеции, дупликации, транслокации и анеуплоидии | Высокая для исследуемого локуса | Исследует только заранее выбранные участки |
| Массивная параллельная ДНК-секвенция | Секвенирование фрагментов с последующим биоинформатическим анализом | Точечные варианты, малые инделы, некоторые CNV и структурные перестройки | Зависит от покрытия и дизайна панели | Для CNV необходимы специальные алгоритмы и достаточная глубина покрытия |
| Референсный интервал | Статистическая граница нормальных значений после нормализации сигнала | Помогает отличать технический шум от истинного отклонения профиля | Не определяет физическое разрешение метода | Не заменяет микроматрицу и не является самостоятельной технологической основой HR-CGH |
HR-CGH особенно применяется при диагностике задержки психомоторного и речевого развития, интеллектуальной недостаточности, расстройств аутистического спектра и врождённых множественных пороков развития. Выявленная вариация числа копий должна оцениваться с учётом размера, генов в критическом интервале, популяционной частоты и клинического фенотипа пациента. При подозрении на сбалансированную перестройку, точечный вариант или низкоуровневый мозаицизм требуются другие методы, включая кариотипирование, FISH или секвенирование. Таким образом, технической основой высокой разрешающей способности является именно плотная система геномных зондов на ДНК-микроматрице.