2) инкубация с соляной кислотой
3) предобработка трипсином (+)
4) предобработка пепсином
Необходимым этапом классического G-окрашивания хромосом является контролируемая предобработка метафазных препаратов трипсином с последующим окрашиванием красителем Гимзы. Такой вариант обозначают как GTG-бэндинг (trypsin–Giemsa). Трипсин вызывает частичный протеолиз хромосомных белков, прежде всего белково-ДНК-связанных структур, вследствие чего изменяется доступность отдельных участков хроматина для красителя и формируется воспроизводимый рисунок чередующихся тёмных и светлых полос.
Тёмные G-полосы преимущественно соответствуют AT-богатым, поздно реплицирующимся участкам с относительно низкой плотностью генов; светлые полосы чаще содержат GC-богатый, рано реплицирующийся и транскрипционно более активный хроматин. Степень трипсинизации имеет принципиальное значение: недостаточная обработка даёт слабый контраст, а чрезмерная приводит к разрушению хромосом и утрате полосчатого рисунка. Именно последовательность частичный протеолиз трипсином — окрашивание Гимзой обеспечивает идентификацию хромосом по стандартам ISCN и выявление численных и структурных перестроек.
Заключение препарата в буфер или глицерин относится к завершающему этапу фиксации и сохранения окрашенного материала и не формирует G-полосы. Обработка соляной кислотой характернее для отдельных вариантов гетерохроматинового, или C-, бэндинга, а пепсин может применяться в модифицированных протоколах, но не является классическим обязательным компонентом GTG-метода.
| Метод | Основная обработка | Характер полос или сигнала | Диагностическое применение |
|---|---|---|---|
| G-бэндинг (GTG) | Частичный протеолиз трипсином, затем окраска Гимзой | Тёмные AT-богатые и светлые GC-богатые участки | Рутинная идентификация хромосом, обнаружение анеуплоидий и структурных перестроек |
| R-бэндинг | Термическая или щелочная денатурация, окраска Гимзой | Рисунок полос противоположен G-бэндингу; лучше визуализируются теломерные области | Анализ терминальных перестроек и участков, плохо различимых при G-окраске |
| C-бэндинг | Кислотная обработка, гидроксид бария, солевой раствор, затем окраска | Выборочное выявление конститутивного гетерохроматина, особенно в центромерах | Оценка центромерных вариантов и крупных блоков гетерохроматина |
| Q-бэндинг | Окраска флуорохромом quinacrine | Флуоресцирующие полосы, сходные по распределению с G-полосами | Исторически — идентификация хромосом и выявление Y-хроматина |
| NOR-бэндинг | Импрегнация нитратом серебра | Выделение активных участков организаторов ядрышка на акроцентрических хромосомах | Оценка активности рибосомных генов, а не полного кариотипирования |
| FISH | Гибридизация флуоресцентно меченых ДНК-зондов с комплементарными последовательностями | Локальные специфические флуоресцентные сигналы | Подтверждение микроделеций, амплификаций, транслокаций и мозаицизма |
Интенсивность и чёткость G-полос оценивают с учётом разрешения препарата и качества метафаз. При подозрении на сложную перестройку результаты GTG-бэндинга сопоставляют с FISH, хромосомным микроматричным анализом или секвенированием. Недостаточная трипсинизация может маскировать мелкие перестройки, тогда как избыточная — создавать артефакты и затруднять интерпретацию. Стандартизованный полосчатый рисунок остаётся основой цитогенетического описания кариотипа.