2) гибридизацию ДНК на матрице РНК
3) перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану (+)
4) ультрацентрифугирование в градиенте плотности
Нозерн-гибридизация — метод молекулярной генетики для выявления специфических молекул РНК, главным образом мРНК, и оценки их размера и относительного содержания. После разделения РНК в денатурирующем агарозном геле методом капиллярного или электрофоретического переноса её иммобилизуют на нитроцеллюлозной либо чаще на нейлоновой мембране. Затем мембрану инкубируют с меченым комплементарным ДНК- или РНК-зондом; образование гибридов выявляют по радиоактивной, флуоресцентной или хемилюминесцентной метке.
Поэтому перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану является ключевым этапом нозерн-гибридизации: он фиксирует разделенные молекулы в том же пространственном расположении, что и в геле, и делает возможным последующее специфическое обнаружение транскрипта. Перенос денатурированной ДНК на мембрану характерен для саузерн-гибридизации, применяемой для анализа геномной ДНК. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности относится к физическим методам разделения нуклеиновых кислот и не является этапом нозерн-гибридизации; сама гибридизация с зондом проводится уже после иммобилизации РНК.
| Метод | Исследуемый материал | Основной этап переноса или фиксации | Диагностическая или исследовательская задача |
|---|---|---|---|
| Нозерн-гибридизация | РНК, преимущественно мРНК | Перенос РНК из геля на мембрану | Определение размера и относительной экспрессии транскрипта |
| Саузерн-гибридизация | Геномная ДНК | Перенос денатурированной ДНК на мембрану | Выявление конкретных генов, вариантов структуры и крупных перестроек ДНК |
| Вестерн-блоттинг | Белки | Перенос белков на мембрану после электрофореза | Идентификация белка с помощью специфических антител и оценка его молекулярной массы |
| RT-PCR и количественная ПЦР | РНК после обратной транскрипции в кДНК | Амплификация целевой последовательности | Высокочувствительное обнаружение и количественная оценка экспрессии генов |
| Гибридизация in situ | ДНК или РНК в клетках и тканях | Фиксация нуклеиновых кислот непосредственно в биологическом образце | Определение клеточной и тканевой локализации последовательности |
| Ультрацентрифугирование в градиенте плотности | Нуклеиновые кислоты, вирусные частицы, органеллы | Разделение по плавучей плотности и коэффициенту седиментации | Фракционирование материала, но не специфическая гибридизационная идентификация |
Интенсивность сигнала при нозерн-анализе обычно сопоставляют с референсным транскриптом или контролем загрузки, что позволяет оценивать относительные различия экспрессии. Размер полосы на мембране помогает отличать альтернативные транскрипты, продукты альтернативного сплайсинга и различные формы процессинга РНК. Метод требует сохранения целостности РНК, поэтому особое значение имеют предотвращение деградации РНКазами и использование денатурирующих условий электрофореза. В современной практике нозерн-гибридизацию во многих задачах заменяют более чувствительные методы RT-qPCR и RNA-seq, однако она сохраняет ценность для визуальной оценки размера транскрипта.