2) разноцветные полосы
3) пики разных цветов (+)
4) пики одного цвета
При автоматическом секвенировании по Сэнгеру образуется набор фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых заканчивается флуоресцентно меченым дидезоксинуклеотидом. При капиллярном электрофорезе фрагменты разделяются по размеру и последовательно проходят через зону лазерного детектирования. Цвет зарегистрированного флуоресцентного сигнала указывает, каким нуклеотидом завершился соответствующий фрагмент, поэтому результат отображается в виде пиков разных цветов.
Электрофореграмма представляет собой график, где по оси абсцисс отражается последовательность миграции фрагментов, а по оси ординат — интенсивность флуоресцентного сигнала. Каждый пик соответствует одной позиции нуклеотидной последовательности, а его цвет — аденину, тимину, гуанину или цитозину. Конкретное соответствие цветов основаниям зависит от модели прибора и программного обеспечения; например, часто аденин отображается зелёным, тимин — красным, гуанин — чёрным, цитозин — синим цветом.
Полосы различной длины характерны прежде всего для визуализации продуктов секвенирования в плоском геле, но не являются типичным представлением результата в автоматическом капиллярном анализаторе. Один цвет для всех сигналов не позволил бы непосредственно различать основания и потребовал бы дополнительной интерпретации. В нормальной гомозиготной или клональной последовательности в каждой позиции определяется преимущественно один высокий пик; наложение пиков разных цветов может указывать на гетерозиготность, смесь матриц или артефакт анализа.
| Элемент анализа | Что отражает | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Положение пика | Порядок прохождения фрагмента через капилляр | Определяет последовательность нуклеотидов |
| Цвет пика | Тип флуоресцентно меченого терминального дидезоксинуклеотида | Позволяет идентифицировать A, T, G или C |
| Высота и площадь пика | Интенсивность зарегистрированного флуоресцентного сигнала | Используются для оценки качества и надёжности вызова основания |
| Одиночный чёткий пик | Преимущественное наличие одного варианта последовательности | Типично для гомозиготного участка или клональной ДНК |
| Два пика разных цветов в одной позиции | Одновременная регистрация двух оснований | Возможна гетерозиготная замена либо смесь матриц |
| Двойные пики после определённой позиции | Смешение рамок считывания фрагментов | Характерно для гетерозиготной инсерции или делеции |
| Шум, широкие или затухающие пики | Низкое качество матрицы, очистки или электрофоретического разделения | Требует осторожной интерпретации и, при необходимости, повторного анализа |
Таким образом, цветовая кодировка является ключевым принципом автоматической регистрации продуктов секвенирования по Сэнгеру. Она обеспечивает непосредственное чтение первичной структуры ДНК по последовательности пиков. Интерпретация должна учитывать не только цвет, но и форму, высоту пиков, фон сигнала и качество участка электрофореграммы. При выявлении сомнительных или смешанных сигналов результат сопоставляют с референсной последовательностью и клиническими данными.