2) увеличения числа митозов
3) получения делящихся клеток
4) задержки делящихся клеток на стадии метафазы
Гипотоническая обработка необходима для получения качественного распластания метафазных хромосом. В гипотоническом растворе, например 0,075 М хлорида калия, вода поступает в клетку по осмотическому градиенту, вследствие чего увеличиваются объём клетки и ядра, хромосомы удаляются друг от друга и после фиксации распределяются на предметном стекле. Это обеспечивает возможность оценить число, структуру и морфологию хромосом при кариотипировании.
Гипотонический этап не стимулирует клеточную пролиферацию и не формирует митотически активные клетки. Он также не блокирует митоз на стадии метафазы: для этого предварительно применяют ингибиторы веретена деления — колхицин или колцемид, которые нарушают полимеризацию микротрубочек и предотвращают расхождение сестринских хроматид. Таким образом, гипотоническая обработка используется уже после накопления клеток в метафазе и направлена главным образом на улучшение их пространственного разделения.
Недостаточная продолжительность или неправильная концентрация гипотонического воздействия приводит к скучиванию хромосом и неудовлетворительному качеству препарата. Чрезмерная обработка может вызвать разрушение клеток, потерю хромосом и появление артефактов. Поэтому оптимальный гипотонический этап является важным условием получения информативной метафазной пластинки.
| Этап или фактор | Основное воздействие | Результат для препарата | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Стимуляция культуры | Активация пролиферации клеток, например фитогемагглютинином для лимфоцитов | Увеличение доли клеток, вступающих в митоз | Формирует исходный материал для последующего получения метафаз |
| Колхицин или колцемид | Ингибирование микротрубочек веретена деления | Задержка клеток в метафазе, когда хромосомы максимально конденсированы | Создаёт оптимальную стадию для подсчёта и анализа хромосом |
| Гипотонический раствор | Осмотический приток воды и набухание клетки и ядра | Разобщение хромосом и улучшение их разброса на стекле | Повышает качество метафазной пластинки и выявляемость структурных перестроек |
| Недостаточная гипотоническая обработка | Неполное набухание клеток | Скучивание, наложение и плохое разделение хромосом | Может затруднить подсчёт и привести к ошибкам кариотипирования |
| Избыточная гипотоническая обработка | Чрезмерное набухание и повреждение клеточных структур | Разрушение клеток, потеря хромосом, разлёт хромосом на большие расстояния | Создаёт риск гипо-/гипердиплоидных артефактов и неполных метафаз |
| Фиксация метанолом и уксусной кислотой | Остановка осмотических изменений и стабилизация хромосом | Сохранение материала и подготовка клеточной суспензии к нанесению на стекло | Влияет на чёткость морфологии и последующее окрашивание |
| Окрашивание и анализ | Дифференциальное выявление полос хромосом или флуоресцентных сигналов | Визуализация кариотипа, участков перестроек или локализации последовательностей ДНК | Позволяет диагностировать числовые и структурные хромосомные аномалии |
Качество метафазной пластинки определяется согласованностью всех этапов, а не только воздействием гипотонического раствора. Оптимальный препарат содержит целую клетку или её равномерно распластанный хромосомный материал без выраженного наложения хромосом. При интерпретации результатов необходимо отличать истинные хромосомные аномалии от артефактов, связанных с чрезмерным набуханием или потерей хромосом. Следовательно, основная цель гипотонической обработки — получение хорошего разброса хромосом.