2) менее 100
3) около 3000
4) более 5000
Оптимальная длина фрагмента для анализа методом секвенирования по Сэнгеру составляет не более 1000 нуклеотидов. Метод основан на включении в растущую цепь ДНК дидезоксинуклеотидов, прекращающих ее синтез; образующийся набор фрагментов разделяют капиллярным электрофорезом и по флуоресцентной метке определяют последовательность. В начале чтения качество сигнала обычно высокое, однако по мере увеличения длины фрагментов пики электрофореграммы расширяются и начинают перекрываться.
Наиболее надежно методом Сэнгера обычно анализируются последовательности длиной примерно 500–800 нуклеотидов, а технически приемлемая длина качественного прочтения может приближаться к 1000 нуклеотидам. После этого возрастает вероятность ошибок интерпретации, особенно в гомополимерных участках, зонах повторов и при снижении интенсивности флуоресцентного сигнала. Поэтому значение не более 1000 нуклеотидов отражает практический предел одного информативного прочтения, а не абсолютную невозможность исследовать более длинный геномный участок.
Для анализа протяженных фрагментов их разделяют на перекрывающиеся ампликоны либо применяют последовательное праймирование (primer walking). Метод особенно эффективен для подтверждения точечных вариантов, небольших вставок и делеций в предварительно определенном участке гена. При наличии смеси матриц, например при неспецифической амплификации или исследовании мозаицизма с низкой долей патологического клона, электрофореграмма становится сложной для интерпретации, что также ограничивает диагностические возможности метода.
| Критерий | Характеристика секвенирования по Сэнгеру | Практическое значение |
|---|---|---|
| Принцип | Терминация синтеза цепи флуоресцентно меченными дидезоксинуклеотидами | Каждый сигнал соответствует определенному нуклеотиду в последовательности |
| Оптимальная длина одного прочтения | Около 500–800 нуклеотидов | Обеспечивается наиболее четкая электрофореграмма и надежный вызов вариантов |
| Практический верхний предел | Не более 1000 нуклеотидов | После этой длины резко возрастает риск перекрытия пиков и снижения качества базового вызова |
| Тип анализируемого материала | Очищенный ПЦР-ампликон или клонированный фрагмент с преимущественно одной матрицей | Неспецифические продукты и смешанные матрицы затрудняют интерпретацию хроматограммы |
| Наиболее подходящие варианты | Точечные замены, небольшие инсерции и делеции | Метод часто используют для подтверждения находок, выявленных высокопроизводительным секвенированием |
| Анализ более длинного участка | Перекрывающиеся ампликоны или последовательное перемещение праймера | Позволяет реконструировать протяженную последовательность из нескольких качественных прочтений |
| Сравнение с NGS | Низкая пропускная способность, но высокая точность при исследовании одного-двух участков | Рационален для таргетного подтверждения, но не для массового анализа больших панелей генов |
Таким образом, ограничение длины связано с физическими особенностями разделения и регистрации фрагментов при капиллярном электрофорезе. Результат следует оценивать по качеству хроматограммы, равномерности пиков и наличию четкого сигнала в зоне предполагаемого варианта. Если исследуемая область превышает один килобаз, предпочтительно использовать несколько перекрывающихся реакций либо технологию секвенирования, рассчитанную на более длинные прочтения.