2) осмотический шок
3) токсичность чужеродного агента
4) неспецифическое связывание с последовательностью ДНК (+)
Ключевым ограничением применения CRISPR/Cas9 в эукариотических клетках является неспецифическое распознавание и последующее расщепление участков ДНК, сходных с заданной мишенью. Комплекс Cas9–направляющая РНК ориентируется по комплементарности последовательностей и наличию PAM-сайта; при этом он способен переносить отдельные несовпадения нуклеотидов, особенно в участках, удалённых от PAM. Поэтому разрыв может возникать не только в целевом локусе, но и в других участках генома.
Нежелательные двуцепочечные разрывы активируют системы репарации, прежде всего негомологичное соединение концов (NHEJ), что приводит к случайным инсерциям и делециям, крупным перестройкам, транслокациям или потере гетерозиготности. Это способно изменять экспрессию генов, активировать онкогенные пути и снижать достоверность результатов редактирования. Апоптоз, осмотический шок и цитотоксичность чужеродного белка могут наблюдаться в отдельных экспериментальных условиях, но не являются основным специфическим ограничением технологии.
| Фактор | Механизм | Практическое значение |
|---|---|---|
| Высокая гомология участка | Направляющая РНК частично комплементарна нескольким локусам | Возрастает вероятность внецелевого связывания и разрыва ДНК |
| Несовпадения вне PAM-проксимальной области | Cas9 может сохранять активность при отдельных mismatch в менее критичной зоне | Даже тщательно выбранная направляющая РНК не гарантирует абсолютной специфичности |
| Наличие PAM-сайта | Для SpCas9 обычно требуется мотив NGG рядом с потенциальной мишенью | Определяет спектр возможных целевых и внецелевых участков |
| Последствия двуцепочечного разрыва | Репарация по механизму NHEJ или альтернативного соединения концов | Формируются инделы, делеции, транслокации и другие геномные перестройки |
| Выявление внецелевых эффектов | Прогнозирование по биоинформатическим алгоритмам дополняют ампликонным секвенированием, GUIDE-seq, CIRCLE-seq или CHANGE-seq | Оцениваются частота и спектр изменений в предполагаемых и неожиданных локусах |
| Снижение риска | Используют высокоспецифичные варианты Cas9, оптимизированные направляющие РНК, укороченные gRNA и кратковременную доставку RNP-комплексов | Уменьшается продолжительность действия нуклеазы и число внецелевых событий |
Перед применением отредактированных клеток необходимо подтверждать правильность целевого изменения и отсутствие клинически значимых внецелевых вариантов. Особое значение имеет оценка клональной стабильности, кариотипа и потенциальных крупных геномных перестроек. В соматической терапии профиль безопасности должен включать не только анализ предполагаемых off-target-локусов, но и методы широкогеномного контроля. Таким образом, основным принципом безопасного редактирования является максимизация специфичности при одновременной верификации геномного результата.