2) использование нескольких ферментов
3) применение нескольких пар праймеров (+)
4) применение нескольких температур отжига
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет одновременно амплифицировать несколько участков нуклеиновой кислоты в одной реакционной смеси. Это достигается за счёт применения нескольких пар праймеров, каждая из которых специфична к своему целевому фрагменту ДНК или кДНК. В результате одним исследованием можно выявить несколько патогенов, мутаций, аллелей либо участков одного гена, что сокращает расход материала и время анализа.
Все праймеры в мультиплексной реакции должны обладать близкими температурами плавления и не образовывать значимых димеров или неспецифических взаимодействий. Поэтому используется единый оптимизированный температурный режим, а не несколько независимых температур отжига. Несколько флуоресцентных красителей могут применяться в мультиплексной ПЦР в реальном времени для раздельной регистрации ампликонов, однако это не является обязательным признаком метода; использование нескольких ферментов также не определяет его сущность.
| Критерий | Мультиплексная ПЦР | Одноплексная ПЦР |
|---|---|---|
| Количество целевых участков | Несколько мишеней амплифицируются одновременно | Амплифицируется преимущественно одна мишень |
| Праймеры | Используется несколько пар праймеров, специфичных к разным участкам | Используется одна пара праймеров |
| Ферментативная система | Обычно применяется одна термостабильная ДНК-полимераза в общей реакционной смеси | Также обычно используется одна ДНК-полимераза |
| Температурный режим | Единый цикл денатурации, отжига и элонгации; температуры подбирают с учётом всех праймеров | Режим оптимизируют для одной пары праймеров |
| Регистрация результата | Возможна электрофоретическая идентификация ампликонов разного размера или детекция разными флуорофорами | Обычно анализируется один ампликон одним методом регистрации |
| Основные ограничения | Конкуренция праймеров за реагенты, неспецифическая амплификация, образование праймер-димеров | Меньше взаимного влияния компонентов реакции |
| Практическое применение | Скрининг нескольких инфекционных агентов, генов или мутаций в одном образце | Подтверждение или количественная оценка одной выбранной мишени |
Ключевым этапом разработки мультиплексной ПЦР является подбор совместимых праймеров и разнесение ампликонов по размерам либо по каналам флуоресценции. Концентрации праймеров и условия реакции могут различаться для отдельных мишеней, чтобы сбалансировать эффективность амплификации. При интерпретации результата необходимо учитывать наличие внутренних и отрицательных контролей, поскольку отсутствие сигнала одной мишени может быть связано как с отсутствием соответствующей последовательности, так и с ингибированием реакции. Таким образом, диагностическая ценность метода основана на одновременном специфическом выявлении нескольких генетических мишеней в одной пробе.