2) культуральной среды фиксатором
3) фиксатора дистиллированной водой
4) гипотонического раствора уксусной кислотой
Префиксация в цитогенетической лаборатории — это этап подготовки клеточной суспензии после гипотонической обработки, при котором часть гипотонического раствора постепенно замещают фиксатором. Обычно применяют метанол-уксуснокислый фиксатор Карнуа в соотношении 3:1. Такое постепенное введение фиксирующей смеси позволяет начать стабилизацию клеточных структур без резкого изменения условий, которое может вызвать агрегацию клеток и повреждение хромосом.
Гипотонический раствор, например 0,075 М хлорид калия, вызывает поступление воды в клетки, их набухание и разрыхление хромосомного материала. Это облегчает последующее распределение метафазных хромосом на предметном стекле. При префиксации осмотическое набухание постепенно прекращается, клеточные мембраны и хромосомы стабилизируются, а риск образования клеточных комков уменьшается. Поэтому замена части гипотонической среды фиксатором является правильным определением данного этапа.
Префиксацию выполняют после инкубации в гипотоническом растворе и центрифугирования клеточной суспензии, обычно перед основными циклами фиксации и отмывки. Полная одномоментная замена гипотонического раствора на фиксатор не является префиксацией и может ухудшить качество цитогенетического препарата. Культуральная среда используется для поддержания жизнеспособности клеток до обработки, а дистиллированная вода не обладает необходимыми фиксирующими свойствами.
| Этап | Основной реагент | Воздействие на клетки | Лабораторная цель |
|---|---|---|---|
| Культивирование | Культуральная среда | Поддерживает жизнеспособность и пролиферацию клеток | Получение достаточного количества делящихся клеток |
| Гипотоническая обработка | Раствор хлорида калия низкой осмолярности | Вызывает набухание клеток и разобщение хромосом | Подготовка метафазных пластинок к микроскопическому анализу |
| Префиксация | Часть гипотонического раствора заменяют метанол-уксуснокислым фиксатором | Постепенно прекращает набухание и начинает стабилизацию структур | Предотвращение резкой агрегации клеток и повреждения хромосом |
| Основная фиксация | Свежий фиксатор, чаще метанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1 | Фиксирует клеточные и хромосомные структуры, удаляет воду | Сохранение морфологии хромосом для приготовления препарата |
| Отмывка и повторная фиксация | Несколько порций фиксирующей смеси | Удаляет остатки гипотонического раствора и клеточный детрит | Повышение чистоты фона и качества окрашивания |
| Приготовление препарата | Фиксированная клеточная суспензия и предметное стекло | Клетки распределяются и высушиваются на стекле | Формирование метафазных пластинок для кариотипирования или FISH |
Качество префиксации оценивают косвенно по равномерности клеточной суспензии, отсутствию крупных агрегатов и сохранности морфологии хромосом. Недостаточная префиксация может привести к слипанию клеток, а слишком агрессивное или быстрое введение фиксатора — к разрушению клеточных структур. Точный порядок обработки и соотношение реагентов должны соответствовать валидированной методике конкретной лаборатории.