2) отсутствие необходимости в дополнительной подготовке образца перед исследованием
3) возможность получить общее представление о флуоресценции
4) возможность охарактеризовать каждую клетку (+)
Преимущество проточной цитометрии заключается в возможности анализировать клетки поодиночке и одновременно регистрировать несколько параметров каждой клетки: интенсивность флуоресценции, характеристики светорассеяния, экспрессию нескольких антигенов и другие признаки. Клеточная суспензия проходит через лазерный пучок в гидродинамически сфокусированном потоке, поэтому клетки последовательно пересекают зону измерения, а детекторы фиксируют сигнал от каждой из них.
Такой принцип позволяет не только определить наличие флуоресцентной метки, но и количественно оценить долю положительных клеток, распределение интенсивности сигнала и существование отдельных субпопуляций. После применения алгоритмов гейтирования можно охарактеризовать фенотип каждой клетки или выделенной клеточной группы, например установить сочетание CD-маркеров на лимфоцитах. Флуоресцентная микроскопия также позволяет исследовать отдельные клетки и их пространственную локализацию, однако обычно имеет меньшую пропускную способность и в большей степени зависит от визуальной оценки изображения.
| Критерий | Проточная цитометрия | Флуоресцентная микроскопия |
|---|---|---|
| Объект исследования | Клетки в суспензии, последовательно проходящие через измерительную зону | Клетки или тканевые структуры, зафиксированные в поле зрения |
| Основной результат | Количественные данные по каждой зарегистрированной клетке | Изображение клеток и распределения флуоресценции в их структурах |
| Оцениваемые признаки | Флуоресценция, прямое и боковое светорассеяние, комбинации маркеров | Интенсивность и локализация сигнала, морфология, внутриклеточное распределение |
| Анализ клеточных субпопуляций | Гейтирование по совокупности параметров и определение доли каждой субпопуляции | Выделение субпопуляций преимущественно по визуальным и морфологическим признакам |
| Пропускная способность | Высокая: возможно исследование тысяч и десятков тысяч клеток за короткое время | Ниже; число анализируемых клеток ограничено площадью обзора и временем визуализации |
| Количественная оценка сигнала | Стандартизированная регистрация интенсивности флуоресценции в относительных единицах | Зависит от настроек микроскопа, экспозиции и условий обработки изображения |
| Подготовка и оснащение | Требуются флуоресцентно меченые клетки, суспензия и специализированный проточный цитометр | Требуются флуоресцентный микроскоп и подготовка препарата; отсутствие специального оборудования не предполагается |
Таким образом, проточная цитометрия обеспечивает многопараметрическую характеристику большого числа отдельных клеток, а не только общее визуальное представление о флуоресценции образца. Этот подход особенно важен для иммунофенотипирования, оценки клеточного цикла, апоптоза и выявления редких популяций. Интерпретация результатов требует корректного выбора контролей, компенсации спектрального перекрытия флуорохромов и обоснованного гейтирования.