2) короткие (+)
3) кольцевые
4) линейные
Молекулы ДНК имеют отрицательный заряд благодаря фосфатным группам сахарофосфатного остова, поэтому в электрическом поле перемещаются от катода к аноду. Агарозный гель действует как молекулярное сито: его пористая структура сильнее препятствует движению крупных фрагментов, тогда как короткие фрагменты легче проходят через поры и мигрируют с большей скоростью.
При одинаковой конформации двухцепочечной линейной ДНК расстояние миграции обратно пропорционально логарифму длины фрагмента, выраженной в парах нуклеотидов. Поэтому после электрофореза наиболее удалённые от стартовой линии полосы соответствуют фрагментам с наименьшей молекулярной длиной. Размер исследуемых фрагментов определяют сравнением их положения с маркером молекулярной массы — набором ДНК-фрагментов известной длины.
Форма молекулы также влияет на электрофоретическую подвижность, особенно при анализе плазмидной ДНК. Суперскрученная кольцевая молекула обычно мигрирует быстрее линейной молекулы той же длины, а релаксированная кольцевая форма — медленнее. Однако при стандартном сравнении линейных фрагментов основным фактором разделения остаётся их размер, поэтому дальше всего перемещаются именно короткие фрагменты.
| Фактор | Влияние на миграцию ДНК | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Длина фрагмента | Короткие фрагменты движутся быстрее и дальше | Основной критерий определения размера линейной ДНК |
| Длинный линейный фрагмент | Сильнее задерживается порами агарозы | Располагается ближе к стартовой линии |
| Короткий линейный фрагмент | Легко проходит через поры геля | Образует полосу на большем расстоянии от старта |
| Суперскрученная кольцевая ДНК | Компактная конформация повышает подвижность | Может мигрировать быстрее линейной ДНК той же длины |
| Релаксированная кольцевая ДНК | Объёмная конформация снижает подвижность | Часто располагается ближе к старту |
| Концентрация агарозы | Высокая концентрация уменьшает размер пор | Улучшает разделение коротких фрагментов |
| Маркер длины ДНК | Содержит фрагменты известного размера | Позволяет оценить длину исследуемых ампликонов |
Агарозный электрофорез широко применяют для контроля продуктов полимеразной цепной реакции, рестрикционного анализа и оценки целостности нуклеиновых кислот. Выбор концентрации геля зависит от предполагаемого диапазона размеров: более плотные гели используют для коротких фрагментов, менее плотные — для крупных. Избыточное напряжение может вызвать перегрев геля и искажение полос, поэтому условия электрофореза стандартизируют. Чёткая одиночная полоса ожидаемого размера подтверждает наличие целевого ампликона, но не доказывает его нуклеотидную последовательность.