2) включение в цепь дидезоксинуклеотида (+)
3) включение дезоксинуклеотида, меченного флуорохромом
4) инактивация ДНК-полимеразы
В секвенировании по Сенгеру удлинение комплементарной цепи прекращается при включении дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). В отличие от обычного дезоксинуклеозидтрифосфата, дидезоксинуклеотид не содержит 3′-гидроксильной группы в сахарном остатке. Поэтому после его присоединения ДНК-полимераза не может сформировать следующую 3′–5′-фосфодиэфирную связь, и дальнейшее наращивание цепи становится невозможным.
В реакционную смесь добавляют преимущественно стандартные dNTP и небольшую долю меченых ddNTP каждого типа. Случайное включение терминатора приводит к образованию набора фрагментов различной длины, каждый из которых заканчивается определённым азотистым основанием. После капиллярного электрофореза фрагменты разделяются по размеру, а последовательность флуоресцентных сигналов позволяет восстановить порядок нуклеотидов в исследуемой ДНК.
Недостаток стандартных нуклеотидов может снизить эффективность реакции, но не является специфическим механизмом контролируемой терминации. Флуорохром служит для детекции нуклеотида и сам по себе не препятствует элонгации, если молекула сохраняет 3′-OH-группу. Инактивация ДНК-полимеразы остановила бы синтез неспецифически во всей реакционной смеси и не обеспечила бы получение упорядоченного набора фрагментов.
| Компонент или процесс | Структурная особенность | Роль в секвенировании по Сенгеру |
|---|---|---|
| Стандартный dNTP | Содержит 3′-OH-группу | Обеспечивает нормальное удлинение синтезируемой цепи ДНК |
| Дидезоксинуклеотид, ddNTP | Не содержит 3′-OH-группы | Вызывает необратимый обрыв цепи после включения |
| Флуоресцентная метка | Связана с терминатором или другим компонентом реакции | Позволяет идентифицировать конечный нуклеотид фрагмента |
| ДНК-полимераза | Катализирует образование фосфодиэфирных связей | Синтезирует цепь до момента включения ddNTP |
| Капиллярный электрофорез | Разделяет фрагменты по длине | Обеспечивает последовательное считывание сигналов от коротких к длинным фрагментам |
| Инактивация полимеразы | Утрата каталитической активности фермента | Вызывает неспецифическое прекращение реакции, а не позиционно-зависимую терминацию |
Метод Сенгера основан на сочетании ферментативного синтеза ДНК, контролируемой терминации цепей и высокоточного разделения полученных фрагментов. Он особенно эффективен для подтверждения точечных вариантов и небольших участков генов. Качество чтения зависит от чистоты матрицы, специфичности праймера и сбалансированного соотношения dNTP и ddNTP. Ключевым химическим условием остановки синтеза остаётся отсутствие 3′-OH-группы у включённого дидезоксинуклеотида.