2) окраски тиазиновыми красителями с последующей детекцией результатов в ультрафиолетовом излучении
3) окраски интеркалирующими красителями с последующей детекцией результатов в ультрафиолетовом излучении (+)
4) облучения в ультрафиолетовом излучении без применения красителей
Правильный ответ основан на способности флуоресцентных красителей связываться с нуклеиновыми кислотами. Классический пример — бромид этидия, молекулы которого интеркалируют между соседними парами оснований двухцепочечной ДНК. После связывания интенсивность флуоресценции красителя значительно возрастает; при возбуждении ультрафиолетовым излучением он испускает видимый свет, благодаря чему разделённые фрагменты выявляются в виде дискретных полос.
Интенсивность полосы приблизительно соответствует количеству содержащейся в ней нуклеиновой кислоты, а положение относительно маркера молекулярной массы позволяет оценить длину фрагмента. Краситель может быть внесён в агарозный гель до электрофореза либо использован для последующего окрашивания. Наряду с бромидом этидия применяются более современные флуоресцентные красители семейства SYBR, некоторые из которых возбуждаются не только ультрафиолетовым, но и синим светом.
Нативные ДНК и РНК не обладают достаточной собственной флуоресценцией для стандартной визуализации полос, поэтому одно ультрафиолетовое облучение без красителя не обеспечивает диагностически значимого изображения. Хемилюминесцентная детекция обычно требует ферментной или иной метки и применяется преимущественно при гибридизационном анализе. Тиазиновые красители, например метиленовый синий, могут окрашивать нуклеиновые кислоты, однако их выявляют преимущественно в видимом свете; чувствительность такого способа обычно ниже, чем у флуоресцентных интеркалирующих красителей.
| Подход | Механизм | Источник возбуждения или регистрации | Практическая оценка |
|---|---|---|---|
| Бромид этидия | Интеркаляция между парами оснований ДНК с усилением флуоресценции | Ультрафиолетовый трансиллюминатор | Классический чувствительный метод; требует соблюдения мер химической и фотобиологической безопасности. |
| Красители SYBR Green, SYBR Gold | Флуоресцентное связывание с нуклеиновыми кислотами, сопровождаемое усилением эмиссии | Ультрафиолетовый или специализированный оптический источник | Высокая чувствительность, пригодность для регистрации малых количеств ДНК. |
| SYBR Safe и аналогичные красители | Связывание с ДНК с формированием флуоресцентного комплекса | Синий свет или ультрафиолетовое излучение | Синий свет уменьшает ультрафиолетовое повреждение выделяемых фрагментов ДНК. |
| Тиазиновые красители | Нефлуоресцентное или слабофлуоресцентное окрашивание нуклеиновых кислот | Преимущественно видимый свет | Не соответствуют стандартной схеме флуоресцентной УФ-детекции; обычно обладают меньшей чувствительностью. |
| Хемилюминесценция | Светообразующая химическая реакция с участием специальной метки | Камера или фотодетектор без внешнего оптического возбуждения | Применима к меченым зондам и мембранным методам, но не является способом прямого выявления немеченой ДНК в обычном агарозном геле. |
| Ультрафиолет без красителя | Специфический флуоресцентный комплекс с нуклеиновой кислотой отсутствует | Ультрафиолетовое излучение | Полосы практически не визуализируются; дополнительным недостатком является риск фотохимического повреждения ДНК. |
При интерпретации электрофореграммы оценивают наличие полос, их размер, интенсивность, чёткость и возможное появление неспецифических продуктов. Диффузное свечение или смир может указывать на деградацию нуклеиновой кислоты, перегрузку дорожки либо неоднородность образца. При необходимости последующего клонирования или секвенирования предпочтительна визуализация синим светом, поскольку длительное ультрафиолетовое воздействие способно вызывать повреждения ДНК. Таким образом, ключевым этапом регистрации является образование флуоресцирующего комплекса красителя с нуклеиновой кислотой, а не непосредственное свечение самой ДНК.