2) протеиназу
3) ДНК-лигазу
4) ДНК-полимеразу (+)
Амплификация фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции основана на многократном синтезе комплементарных цепей. Ключевым ферментом реакционной смеси является термостабильная ДНК-полимераза, например Taq-полимераза или высокоточная proofreading-полимераза. Она катализирует присоединение дезоксирибонуклеотидтрифосфатов к 3′-концу праймера в направлении 5′→3′, используя матричную ДНК и праймер как начальную точку синтеза.
В каждом цикле ПЦР последовательно происходят денатурация ДНК, отжиг праймеров и элонгация — достраивание новых цепей при оптимальной температуре для используемой полимеразы. Повторение циклов приводит к экспоненциальному накоплению целевого ампликона, что лежит в основе выявления инфекционных агентов, генетических вариантов и мутаций. Для работы фермента также необходимы праймеры, дНТФ, ионы магния, буфер с оптимальным pH и матричная нуклеиновая кислота.
| Компонент | Роль в стандартной ПЦР | Особенности и диагностическое значение |
|---|---|---|
| Термостабильная ДНК-полимераза | Синтезирует новую цепь ДНК по матрице | Обязательный фермент; определяет эффективность, специфичность и, у ряда ферментов, точность амплификации |
| Матричная ДНК | Содержит амплифицируемую последовательность | Может быть геномной, плазмидной или полученной после обратной транскрипции РНК |
| Праймеры | Фланкируют целевой участок и предоставляют 3′-OH-группу для начала синтеза | Их последовательность определяет специфичность амплификации и размер продукта |
| Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты | Служат строительным материалом для формируемой цепи ДНК | Должны присутствовать в сбалансированной концентрации; их дефицит ограничивает выход продукта |
| Ионы Mg2+ | Необходимы для каталитической активности полимеразы и связывания дНТФ | Изменение концентрации влияет на выход ампликона и риск неспецифических продуктов |
| Буферный раствор | Поддерживает оптимальные pH и ионную силу реакции | Состав буфера подбирают с учетом конкретной ДНК-полимеразы и типа образца |
| Флуоресцентный краситель или зонд | Позволяет регистрировать накопление продукта в режиме реального времени | Используется в количественной ПЦР, но не является обязательным для конечной детекции ампликона |
| Рестриктаза, протеаза, ДНК-лигаза | Не выполняют основную функцию стандартной ПЦР | Могут применяться на этапах пробоподготовки или в специальных методиках, но не заменяют ДНК-полимеразу |
Выбор полимеразы зависит от задачи: для рутинной диагностики часто используют Taq-полимеразу, а для анализа последовательности или выявления вариантов, чувствительных к ошибкам амплификации, — ферменты с корректорной 3′→5′-экзонуклеазной активностью. При исследовании РНК в реакцию дополнительно включают обратную транскриптазу, которая сначала синтезирует комплементарную ДНК. Результат ПЦР оценивают по наличию специфического ампликона, кривой флуоресценции или его количественным параметрам в зависимости от формата исследования. Обязательными условиями достоверности являются отрицательный контроль, положительный контроль и контроль адекватности выделения нуклеиновой кислоты.