2) отжигом (+)
3) горячим стартом
4) плавлением
Отжиг — этап амплификационного цикла, на котором после денатурации температура реакционной смеси снижается, и одноцепочечные праймеры комплементарно связываются с соответствующими участками ДНК-матрицы. Такое взаимодействие основано на образовании водородных связей между парными азотистыми основаниями и определяет границы фрагмента, который будет многократно копироваться в последующих циклах.
Температура отжига подбирается с учетом температуры плавления праймеров и обычно находится немного ниже нее. При чрезмерно высокой температуре праймеры связываются с матрицей недостаточно эффективно, что снижает выход продукта; при слишком низкой возрастает вероятность неспецифической гибридизации и образования побочных ампликонов. После формирования комплекса праймер–матрица ДНК-полимераза получает свободную 3′-гидроксильную группу, от которой начинается синтез новой цепи.
| Этап или технологический прием | Температурный режим | Основной процесс | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Денатурация | Обычно 94–98 °C | Разделение двух цепей ДНК вследствие разрушения водородных связей | Обеспечивает доступ праймеров к одноцепочечной матрице |
| Отжиг | Чаще 50–65 °C | Комплементарная гибридизация праймеров с целевыми последовательностями | Определяет специфичность амплификации |
| Элонгация | Обычно около 72 °C | Синтез новой цепи ДНК термостабильной полимеразой | Приводит к образованию копии целевого фрагмента |
| Начальная денатурация | 94–98 °C в течение нескольких минут | Полное расплетание исходной ДНК и активация некоторых полимераз | Повышает эффективность первого цикла |
| Финальная элонгация | Около 72 °C | Завершение синтеза неполностью достроенных цепей | Способствует получению полноразмерных ампликонов |
| Горячий старт | Активация фермента при высокой температуре | Предотвращение преждевременной активности полимеразы до начала циклирования | Снижает неспецифическую амплификацию и образование димеров праймеров |
Специфичность ПЦР во многом зависит от правильного дизайна праймеров, содержания гуанина и цитозина, отсутствия выраженной самокомплементарности и оптимального температурного режима. В лабораторной генетике нарушение условий отжига может привести как к ложноотрицательному результату из-за слабой амплификации, так и к ложноположительной интерпретации при появлении неспецифических продуктов. Для контроля качества реакции используют положительные, отрицательные и внутренние контроли амплификации. Оптимизация этапа отжига особенно важна при выявлении редких мутаций и анализе образцов с низкой концентрацией ДНК.