2) качественного и количественного результата (+)
3) только полуколичественного результата
4) только количественного результата
ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ, qPCR) предусматривает регистрацию накопления ампликона непосредственно в процессе циклов реакции по изменению флуоресценции. Сигнал формируется за счёт интеркалирующего красителя, например SYBR Green, либо специфического флуоресцентного зонда. Наличие экспоненциального увеличения сигнала выше заданного порога подтверждает присутствие целевой нуклеиновой кислоты, что обеспечивает качественную оценку.
Количественная оценка основана на определении значения Cq (или Ct) — номера цикла, на котором флуоресценция пересекает порог обнаружения. Чем больше исходное количество матрицы, тем раньше достигается порог и тем меньше значение Cq. Абсолютную концентрацию рассчитывают по калибровочной кривой, построенной на стандартах с известным количеством копий, а относительное содержание — сравнением Cq исследуемой мишени с референсным геном, например методом ΔΔCq. Поэтому технология позволяет получать как качественный, так и количественный результат, хотя количественная интерпретация требует валидированной эффективности реакции и соответствующих стандартов или контролей.
В отличие от обычной ПЦР с регистрацией продукта после завершения реакции, ПЦР-РВ анализирует флуоресценцию в экспоненциальной фазе амплификации, до наступления плато. Это повышает аналитическую информативность и снижает риск контаминации, поскольку отпадает необходимость вскрывать пробирки для электрофоретического анализа. При исследовании РНК предварительно выполняют обратную транскрипцию; такая методика обозначается как ОТ-ПЦР в реальном времени (RT-qPCR).
| Подход | Источник сигнала | Основной результат | Особенности интерпретации |
|---|---|---|---|
| Обычная ПЦР с анализом конечного продукта | Электрофоретическая полоса | Преимущественно качественный | Интенсивность полосы плохо отражает исходное количество матрицы из-за выхода реакции на плато |
| ПЦР-РВ с интеркалирующим красителем | Флуоресценция, пропорциональная количеству двуцепочечной ДНК | Качественный и количественный | Требует анализа кривой плавления для контроля неспецифических ампликонов |
| ПЦР-РВ со специфическим зондом | Флуоресценция репортера после разрушения зонда | Качественный и количественный | Высокая специфичность, возможность мультиплексного анализа нескольких мишеней |
| Абсолютное количественное определение | Значение Cq и калибровочная кривая | Число копий или концентрация | Используются стандарты с известным содержанием целевой последовательности |
| Относительное количественное определение | Сопоставление Cq мишени и референсного гена | Изменение экспрессии или относительная доля | Применяются нормализующие гены и методы ΔCq/ΔΔCq |
| RT-qPCR при исследовании РНК | Сигнал амплификации кДНК после обратной транскрипции | Наличие и количество РНК-мишени | Контролируются эффективность обратной транскрипции и отсутствие геномной ДНК |
| Контроль аналитической пригодности | Кривые положительного, отрицательного и внутреннего контроля | Подтверждение достоверности результата | Учитываются предел обнаружения, предел количественного определения и ингибирование реакции |
Качественный вывод определяется фактом специфической амплификации с учётом отрицательных контролей. Количественный вывод допустим только в диапазоне, подтверждённом валидацией методики, и при соблюдении требований к калибровке. Значения Cq нельзя интерпретировать изолированно без оценки эффективности реакции и качества образца. Таким образом, главным преимуществом ПЦР в реальном времени является сочетание обнаружения мишени с измерением её содержания.