2) денатурация, отжиг праймеров, разрушение праймера
3) разрушение хонда, денатурация, элонгация
4) гибридизация, рестрикция, денатурация
Правильная последовательность основных стадий полимеразной цепной реакции включает денатурацию ДНК, отжиг праймеров и элонгацию. При денатурации двуцепочечная ДНК нагревается, что приводит к разрыву водородных связей между комплементарными цепями и образованию одноцепочечных матриц. Затем при снижении температуры короткие олигонуклеотидные праймеры специфически связываются с комплементарными участками исследуемой ДНК — эта стадия называется отжигом.
На стадии элонгации термостабильная ДНК-полимераза удлиняет праймеры в направлении 5′→3′, присоединяя дезоксирибонуклеотиды и синтезируя новые цепи ДНК. Повторение этих трех стадий в течение нескольких десятков циклов обеспечивает экспоненциальное накопление целевого фрагмента, поскольку вновь синтезированные молекулы становятся матрицами в последующих циклах. Температурные параметры каждого этапа зависят от используемой полимеразы, состава реакционной смеси и температуры плавления праймеров.
Разрушение праймеров, рестрикция и гибридизация как самостоятельная замена перечисленных этапов не относятся к стандартному циклу амплификации ПЦР. Рестрикция выполняется специфическими эндонуклеазами и используется в отдельных методах анализа ДНК, а гибридизация может применяться для выявления определенных последовательностей или лежать в основе связывания праймеров и зондов, но не заменяет последовательность денатурация — отжиг — элонгация .
| Этап/компонент | Основной процесс | Типичная роль в ПЦР |
|---|---|---|
| Начальная денатурация | Разделение двуцепочечной ДНК | Обеспечивает доступ праймеров к матрице перед началом циклирования |
| Денатурация в цикле | Разрыв водородных связей между цепями ДНК | Формирует одноцепочечные матрицы для следующего этапа |
| Отжиг праймеров | Комплементарное связывание праймеров с матричной ДНК | Определяет границы и специфичность амплифицируемого фрагмента |
| Элонгация | Синтез ДНК термостабильной ДНК-полимеразой | Образует новые копии целевого участка |
| Праймеры | Короткие синтетические олигонуклеотиды | Предоставляют свободный 3′-конец для начала синтеза ДНК |
| ДНК-полимераза | Последовательное присоединение нуклеотидов | Катализирует удлинение новой цепи в направлении 5′→3′ |
| Рестрикция | Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами | Не является обязательной стадией стандартного ПЦР-цикла |
Эффективность ПЦР определяется прежде всего специфичностью праймеров, корректным температурным режимом и активностью ДНК-полимеразы. При оптимальных условиях количество целевого продукта в ранних циклах теоретически увеличивается примерно вдвое за каждый цикл. В лабораторной генетике ПЦР используется для выявления мутаций, генотипирования, анализа инфекционных агентов и других задач молекулярной диагностики. В вариантах ПЦР в реальном времени к основным этапам амплификации дополнительно присоединяется регистрация флуоресцентного сигнала, позволяющая оценивать накопление продукта непосредственно в ходе реакции.