2) ДНК-полимераза
3) ДНК-лигаза
4) ионы магния
В классическом MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) исследуют геномную ДНК, поэтому обратная транскриптаза в реакционной смеси не требуется. Этот фермент синтезирует комплементарную ДНК на матрице РНК и используется преимущественно в методах анализа экспрессии, например ОТ-ПЦР. В MLPA матрицей служит непосредственно ДНК, содержащая исследуемые экзоны или другие таргетные участки.
Принцип MLPA включает денатурацию ДНК, гибридизацию двух частей зондов с соседними участками мишени и их сшивание ДНК-лигазой. Только полностью гибридизованные и лигированные зонды эффективно амплифицируются универсальными праймерами с помощью ДНК-полимеразы. Ионы магния необходимы как кофакторы ферментативных реакций, прежде всего полимеразной, поэтому ДНК-лигаза, ДНК-полимераза и Mg2+ относятся к функционально значимым компонентам протокола.
После ПЦР продукты разделяют методом капиллярного электрофореза и оценивают относительную высоту пиков. Снижение или увеличение сигнала относительно контрольных образцов указывает соответственно на делецию или дупликацию исследуемого участка; таким образом, MLPA применяется преимущественно для выявления изменений числа копий экзонов и генов.
| Компонент или этап | Роль в MLPA | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Геномная ДНК | Матрица, содержащая исследуемые последовательности | Позволяет оценивать число копий экзонов и отдельных генов |
| Две части MLPA-зонда | Гибридизуются с соседними участками ДНК-мишени | Обеспечивают специфичность анализа и формируют амплифицируемый фрагмент |
| ДНК-лигаза | Сшивает соседние части зонда при их корректной гибридизации | Связывает образование продукта с наличием соответствующей последовательности-мишени |
| ДНК-полимераза | Амплифицирует лигированные зонды в ПЦР | Формирует измеряемый сигнал, пропорциональный количеству лигированного продукта |
| Ионы Mg2+ | Кофакторы полимеразной и других ферментативных реакций | Необходимы для эффективного синтеза ампликона и корректного протекания реакции |
| Универсальные праймеры | Обеспечивают амплификацию различных лигированных зондов в одной ПЦР | Позволяют одновременно анализировать множество локусов |
| Ревертаза | Синтезирует ДНК на матрице РНК | Не используется в стандартном DNA-MLPA, поскольку анализ проводится без стадии обратной транскрипции |
Следовательно, отмеченный вариант является правильным: обратная транскриптаза не относится к обязательным компонентам стандартной смеси для MLPA. Ее включение было бы обосновано при исследовании РНК с предварительным получением кДНК, но это уже иной формат лабораторного анализа. Интерпретация результатов MLPA требует учета контрольных образцов, качества ДНК и относительной нормализации пиков.