2) направленного пересеквенирования генома
3) сравнительной геномной гибридизации (+)
4) электрофореза ДНК в полиакриламидном геле
Сравнительная геномная гибридизация позволяет выявлять вариации числа копий — делеции и дупликации участков генома, приводящие к уменьшению или увеличению количества генетического материала относительно референсного образца. При матричной сравнительной геномной гибридизации, или array-CGH, ДНК пациента и контрольную ДНК метят различными флуоресцентными красителями, совместно гибридизуют с множеством геномных зондов и оценивают соотношение интенсивности сигналов.
Преобладание сигнала ДНК пациента указывает на увеличение числа копий исследуемого участка, а снижение сигнала — на потерю генетического материала. Разрешающая способность метода зависит от плотности и расположения зондов на микроматрице и значительно превосходит стандартное кариотипирование при поиске субмикроскопических хромосомных перестроек. Метод применяется при диагностике врождённых аномалий, задержки психомоторного развития, интеллектуальных нарушений, расстройств аутистического спектра и множественных пороков развития.
Обычный электрофорез разделяет фрагменты ДНК преимущественно по размеру и не обеспечивает полногеномной количественной оценки числа копий. Направленное пересеквенирование ориентировано прежде всего на поиск нуклеотидных замен и небольших вставок или делеций в выбранных генах; выявление CNV с его помощью возможно только при специальном биоинформатическом анализе глубины покрытия и требует подтверждения валидированным методом.
| Метод | Основная диагностическая задача | Возможности выявления CNV | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| Матричная сравнительная геномная гибридизация | Полногеномный поиск несбалансированных изменений | Выявляет микроделеции и микродупликации с разрешением, определяемым плотностью зондов | Не определяет сбалансированные транслокации и инверсии |
| SNP-микроматрица | Оценка числа копий и генотипирование полиморфизмов | Обнаруживает CNV, участки потери гетерозиготности и однородительскую дисомию | Интерпретация некоторых вариантов требует исследования родителей |
| Стандартное кариотипирование | Анализ числа и структуры хромосом | Выявляет крупные делеции и дупликации, а также сбалансированные перестройки | Низкая чувствительность к субмикроскопическим изменениям |
| MLPA | Исследование заранее выбранных локусов | Точно определяет делеции и дупликации отдельных экзонов или генов | Не подходит для полногеномного скрининга |
| Количественная ПЦР | Прицельная оценка дозы конкретного фрагмента | Используется для подтверждения известной или предполагаемой CNV | Исследуется ограниченное число участков |
| Направленное секвенирование | Поиск вариантов последовательности в панели генов | Может выявлять CNV по изменению глубины покрытия | Чувствительность зависит от дизайна панели и алгоритма анализа |
| Гелевый электрофорез | Разделение фрагментов ДНК по длине | Не предназначен для надёжной оценки числа копий в геноме | Не обеспечивает количественного полногеномного анализа |
Результаты array-CGH описывают с указанием геномных координат, размера изменённого участка и затронутых генов. Выявленный вариант классифицируют как патогенный, вероятно патогенный, вариант неопределённого клинического значения, вероятно доброкачественный или доброкачественный. Для уточнения клинической значимости CNV сопоставляют лабораторные данные с фенотипом пациента и при необходимости исследуют родителей. Обнаружение сбалансированной перестройки или точечной мутации требует применения других цитогенетических либо молекулярно-генетических методов.