2) обратную транскрипцию (+)
3) амплификацию в реальном времени
4) инкубацию биологической пробы в лизирующем буфере
Полимеразная цепная реакция амплифицирует молекулы ДНК, поэтому геном РНК-содержащего вируса не может непосредственно служить матрицей для стандартной ПЦР. На первом этапе вирусную РНК с помощью фермента обратной транскриптазы преобразуют в комплементарную ДНК — кДНК. Полученная кДНК затем используется как матрица для циклического синтеза и накопления специфического участка вирусного генома.
Метод, включающий обратную транскрипцию и последующую амплификацию, обозначают как ОТ-ПЦР, или RT-PCR. При количественном определении вирусной РНК обратную транскрипцию сочетают с ПЦР в реальном времени — RT-qPCR, регистрируя флуоресцентный сигнал в каждом цикле. Выделение нуклеиновых кислот, обработка лизирующим буфером и использование микроцентрифужных колонок относятся к пробоподготовке, но сами по себе не обеспечивают превращения РНК в субстрат, доступный ДНК-полимеразе.
| Этап или подход | Основная функция | Значение при выявлении РНК-вирусов |
|---|---|---|
| Лизис биологического материала | Разрушение клеток и вирусных частиц, высвобождение нуклеиновых кислот | Подготовительный этап, не заменяющий обратную транскрипцию |
| Экстракция РНК | Очистка вирусной РНК от белков, ингибиторов и других компонентов образца | Повышает чувствительность и воспроизводимость исследования |
| Обратная транскрипция | Синтез кДНК на матрице вирусной РНК | Обязательный этап перед ПЦР-амплификацией РНК-мишени |
| Обычная ПЦР | Накопление специфического фрагмента кДНК с помощью праймеров | Позволяет установить наличие вирусного генетического материала |
| ПЦР в реальном времени | Флуоресцентная регистрация продукта во время амплификации | Обеспечивает высокочувствительное качественное или количественное выявление |
| ПЦР для ДНК-содержащих вирусов | Непосредственная амплификация выделенной вирусной ДНК | Этап обратной транскрипции не требуется |
| Отрицательный контроль | Выявление контаминации реактивов или рабочей зоны | Необходим для подтверждения достоверности отрицательных и положительных результатов |
Качество диагностики зависит не только от амплификации, но и от сохранности РНК, поскольку она легко разрушается рибонуклеазами. Для контроля всего процесса в реакцию включают внутренний контроль, позволяющий обнаружить ошибки экстракции или ингибирование ферментов. Результат интерпретируют с учетом порогового цикла, валидности контролей и клинического материала, из которого получен образец. Обнаружение вирусной РНК подтверждает присутствие генетического материала возбудителя, но не всегда свидетельствует о наличии жизнеспособного инфекционного вируса.