2) физическим
3) химическим
4) биологическим
Фотометрия относится к физико-химическим методам анализа, поскольку объединяет измерение физического сигнала с оценкой химического состава исследуемого материала. В ходе исследования регистрируется интенсивность светового потока, прошедшего через раствор, поглощённого им или рассеянного частицами. По величине оптического сигнала рассчитывают концентрацию аналита, поэтому результат отражает не только физическое свойство света, но и химическую характеристику образца.
В клинической биохимии фотометрическое определение часто основано на образовании окрашенного продукта реакции. Согласно закону Бугера—Ламберта—Бера, оптическая плотность раствора в пределах линейного диапазона пропорциональна концентрации вещества: A = ε·l·c, где A — оптическая плотность, ε — молярный коэффициент поглощения, l — длина оптического пути, c — концентрация. На практике используют холостую пробу, калибратор или калибровочную кривую, а измерение проводят на определённой длине волны, соответствующей максимуму поглощения продукта реакции.
Фотометрия не является чисто химическим методом, так как количественный результат получают инструментальной регистрацией света, а не только по факту протекания реакции. Она также не относится к биологическим методам, поскольку для анализа не требуется оценивать ответ живой системы или использовать биологический объект. Отнесение к физико-химическим методам подчёркивает сочетание оптического физического явления и химико-аналитического определения вещества.
| Метод или группа | Регистрируемый параметр | Основной принцип | Применение и отличительная особенность |
|---|---|---|---|
| Фотометрия | Интенсивность светового потока или оптическая плотность | Связь оптического сигнала с концентрацией вещества | Широко используется для определения субстратов, ферментов, метаболитов и продуктов иммунобиохимических реакций |
| Спектрофотометрия | Поглощение света на заданной длине волны или в спектральном диапазоне | Измерение абсорбции с высокой спектральной селективностью | Подходит для прямого определения веществ и кинетических ферментативных анализов |
| Колориметрия | Интенсивность окраски раствора | Сравнение окраски или измерение поглощения видимого света окрашенным соединением | Часто применяется после химической реакции с образованием хромофора |
| Флуориметрия | Интенсивность флуоресцентного излучения | Регистрация света, испускаемого возбуждёнными молекулами | Обеспечивает высокую чувствительность при определении низких концентраций аналитов |
| Турбидиметрия | Уменьшение интенсивности проходящего света | Поглощение и рассеяние света взвешенными частицами | Используется для оценки мутности, в том числе при иммунных реакциях с образованием агрегатов |
| Нефелометрия | Интенсивность света, рассеянного под углом к падающему лучу | Измерение рассеяния света частицами дисперсной системы | Применяется для количественного определения иммуноглобулинов, компонентов комплемента и других белков |
| Химические методы | Расход реагента, объём, масса или химический эквивалент | Стехиометрическая реакция, титрование или гравиметрическое выделение вещества | Оптическая регистрация не является обязательной, поэтому такие методы принципиально отличаются от фотометрии |
Достоверность фотометрического результата зависит от правильного выбора длины волны, стабильности реагентов и соблюдения времени инкубации. Существенное влияние могут оказывать гемолиз, иктеричность и липемия образца, поскольку они изменяют фон или рассеяние света. При выходе реакции за пределы линейности концентрацию следует определять после разведения образца или по соответствующей калибровочной модели. В автоматических биохимических анализаторах фотометрия лежит в основе как конечных, так и кинетических методов измерения.