2) отражению
3) пропусканию
4) рассеиванию
Абсорбция в фотометрии — это поглощение веществом части светового излучения определённой длины волны. Количественно поглощение выражают через оптическую плотность (абсорбанс) A, которая характеризует ослабление светового потока при прохождении через исследуемый раствор. Поэтому абсорбанс и оптическая плотность рассматриваются как эквивалентные понятия.
Оптическая плотность рассчитывается по формуле A = lg(I0/I) = −lg T, где I0 — интенсивность падающего света, I — интенсивность прошедшего света, а T — коэффициент пропускания. В соответствии с законом Бугера—Ламберта—Бера при постоянных длине оптического пути и длине волны величина A = εlc, то есть пропорциональна концентрации поглощающего вещества. На этом принципе основано количественное определение гемоглобина, билирубина, глюкозы, ферментов и других компонентов биологических образцов.
Пропускание отражает долю света, прошедшую через образец, а отражение и рассеивание характеризуют другие способы взаимодействия излучения с веществом. В реальном анализе мутность, взвешенные частицы, гемолиз или липемия могут дополнительно ослаблять свет за счёт рассеивания и приводить к ложному увеличению измеряемой оптической плотности. Для повышения точности используют холостую пробу, контрольные материалы, подходящую длину волны и калибровочную зависимость.
| Величина или явление | Физический смысл | Основное соотношение или признак | Значение для лабораторного анализа |
|---|---|---|---|
| Оптическая плотность (абсорбанс) | Мера поглощения света исследуемым веществом | A = lg(I0/I); безразмерная величина | Используется для расчёта концентрации аналита |
| Пропускание | Доля светового потока, прошедшая через образец | T = I/I0; A = −lg T | При увеличении пропускания оптическая плотность уменьшается |
| Отражение | Возврат части излучения от поверхности или границы сред | R = Ir/I0 | Не является эквивалентом абсорбции в классической фотометрии |
| Рассеивание | Изменение направления света частицами или неоднородностями среды | Вызывает мутность и дополнительное ослабление прямого пучка | Может искажать результат при липемии, преципитации и бактериальном росте |
| Закон Бугера—Ламберта—Бера | Зависимость абсорбанса от концентрации и длины оптического пути | A = εlc | Обеспечивает количественную фотометрическую оценку в линейном диапазоне |
| Аналитическая длина волны | Длина волны, при которой вещество поглощает наиболее эффективно | Часто выбирают область максимума поглощения, λmax | Повышает чувствительность и селективность определения |
В биохимическом анализаторе обычно регистрируется интенсивность прошедшего света, после чего автоматически вычисляется абсорбанс. Чем выше концентрация окрашенного или поглощающего компонента, тем больше его оптическая плотность в пределах линейности методики. Нарушение закона Бугера—Ламберта—Бера возможно при слишком высокой концентрации, полихроматическом излучении, химических реакциях аналита или выраженной мутности образца. Поэтому корректная интерпретация результата требует соблюдения условий измерения и контроля аналитической линейности.