2) 30-40
3) 40-50
4) 60-70
Правильный ответ — 50–60 °C. После денатурации ДНК при высокой температуре её цепи разделяются, затем температура реакционной смеси снижается до уровня, при котором праймеры могут комплементарно связаться с соответствующими участками матрицы. Этот этап называется отжигом, или гибридизацией, праймеров, и именно он определяет специфичность последующего синтеза ампликона.
Температуру отжига подбирают с учётом температуры плавления (Tm) праймеров — температуры, при которой примерно половина праймер-матричных дуплексов распадается. Обычно отжиг проводят на 3–5 °C ниже расчётной Tm, поэтому в стандартной ПЦР часто используют диапазон 50–60 °C. При чрезмерно низкой температуре возможно неспецифическое связывание праймеров и образование побочных продуктов, а при чрезмерно высокой — недостаточная гибридизация и снижение выхода целевого ампликона.
После отжига ДНК-полимераза удлиняет праймеры, присоединяя нуклеотиды в направлении 5′→3′; оптимальная температура этого этапа для большинства термостабильных полимераз составляет около 72 °C. Таким образом, температурный режим ПЦР обеспечивает последовательное разделение цепей, специфическое узнавание целевого участка и его экспоненциальное копирование.
| Этап ПЦР | Типичный температурный диапазон | Основной молекулярный процесс | Диагностическое и методическое значение |
|---|---|---|---|
| Начальная денатурация | ม 94–98 °C | Разделение исходных двуцепочечных молекул ДНК | Обеспечивает доступ праймеров к матричным цепям; особенно важна при использовании сложных матриц |
| Денатурация в цикле | 94–98 °C | Разрыв водородных связей между комплементарными цепями | Подготавливает каждую цепь к независимому копированию в следующем цикле |
| Отжиг праймеров | Обычно 50–60 °C | Комплементарная гибридизация праймеров с матрицей | Определяет специфичность реакции; температуру выбирают относительно Tm праймеров |
| Элонгация | Около 72 °C | Удлинение праймера термостабильной ДНК-полимеразой | Формирование новых цепей и накопление целевого ампликона |
| Слишком низкая температура отжига | Ниже оптимальной для данных праймеров | Ослабление требований к комплементарности | Неспецифические ампликоны, смазанная электрофоретическая картина, возможные праймер-димеры |
| Слишком высокая температура отжига | Выше оптимальной для данных праймеров | Недостаточная стабильность праймер-матричных дуплексов | Снижение эффективности реакции или отсутствие видимого продукта |
Оптимизация температуры отжига особенно важна при мультиплексной ПЦР, анализе низкокопийной мишени и работе с праймерами, имеющими различную температуру плавления. При необходимости применяют градиентную ПЦР, одновременно проверяя несколько близких температур. На результат также влияют концентрации магния, праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов и свойства матрицы.