2) фиксированного антигена и антитела
3) антигена, антитела и комплемента
4) антигена и меченого антитела (+)
Прямой иммуногистохимический метод основан на специфическом связывании антигена в срезе ткани или клеточном препарате с антителом, непосредственно конъюгированным с маркером. В качестве метки используют флуорохром, фермент, коллоидное золото или другой визуализируемый компонент. Поэтому результат реакции определяется взаимодействием антигена с меченым антителом, что соответствует отмеченному варианту.
Перед исследованием ткань фиксируют и готовят гистологический срез; при этом важно сохранить доступность антигенных детерминант для антитела. После инкубации несвязавшийся реагент отмывают, а локализацию комплекса антиген—меченое антитело выявляют по флуоресценции либо по окрашенному продукту ферментативной реакции. Комплемент в прямой иммуногистохимии не требуется, а использование растворимого антигена характернее для ряда иммунологических реакций in vitro, но не определяет данный гистологический метод.
| Признак | Прямой метод | Непрямой метод |
|---|---|---|
| Антитело, непосредственно связывающее антиген | Первичное антитело | Первичное немеченое антитело |
| Метка | Нанесена непосредственно на первичное антитело | Находится на вторичном антителе, распознающем первичное |
| Основной сигнал | Возникает сразу после связывания меченого первичного антитела с антигеном | Формируется после присоединения меченого вторичного антитела |
| Чувствительность | Обычно ниже, поскольку на один антигенный комплекс приходится одна метка первичного антитела | Выше за счёт присоединения нескольких вторичных антител к одному первичному |
| Специфичность и фон | Меньше этапов реакции, как правило, ниже неспецифический фон | Больше этапов, необходимы контроль перекрёстного связывания и подбор вторичного антитела |
| Практическое применение | Быстрое выявление заранее известного антигена в ткани | Рутинная диагностика, когда требуется высокая чувствительность и усиление сигнала |
Диагностическая ценность метода зависит от специфичности антитела, качества фиксации, сохранности антигенов и правильного выбора положительного и отрицательного контролей. Положительная реакция должна иметь ожидаемую тканевую и клеточную локализацию, а не только определённую интенсивность окрашивания. Интерпретацию проводят с учётом морфологии, клинических данных и панели иммуногистохимических маркеров. Прямой подход особенно удобен для быстрого обнаружения конкретного антигена, тогда как непрямой чаще выбирают при необходимости повысить чувствительность исследования.