2) аффинной хроматографии (+)
3) проточной флуорометрии
4) ионообменной хроматографии
Аффинная хроматография основана на высокоспецифическом и обратимом взаимодействии выделяемой макромолекулы с комплементарным лигандом, иммобилизованным на неподвижной фазе. В качестве пар взаимодействия могут выступать антиген–антитело, фермент–субстратный аналог, рецептор–лиганд, лектин–углевод или белок с полигистидиновой меткой–ионы никеля. Благодаря молекулярному узнаванию целевой компонент избирательно удерживается в колонке, тогда как большинство примесей удаляется при промывании.
После удаления несвязавшихся веществ целевую макромолекулу элюируют, то есть переводят в подвижную фазу, изменяя pH, ионную силу раствора либо добавляя конкурентный свободный лиганд. Специфичность связывания обеспечивает высокую степень очистки, нередко за одну хроматографическую стадию. В отличие от этого, адсорбционная и ионообменная хроматография разделяют вещества преимущественно по неспецифической сорбции или электрическому заряду, а проточная флуориметрия предназначена главным образом для анализа и сортировки клеток и частиц.
| Метод | Основа разделения | Особенности | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Аффинная хроматография | Специфическое взаимодействие целевой молекулы с иммобилизованным лигандом | Высокая селективность и значительная степень очистки | Выделение ферментов, антител, рецепторов и рекомбинантных белков |
| Ионообменная хроматография | Различия суммарного электрического заряда молекул | Связывание зависит от pH и ионной силы среды | Фракционирование белков, пептидов и нуклеиновых кислот |
| Адсорбционная хроматография | Различия способности компонентов адсорбироваться на поверхности сорбента | Взаимодействия менее специфичны, возможна необратимая сорбция | Разделение органических соединений, пигментов и липидов |
| Гель-фильтрация | Различия гидродинамического размера молекул | Крупные молекулы выходят из колонки раньше мелких | Обессоливание, определение молекулярной массы, разделение белков |
| Гидрофобная хроматография | Различия выраженности гидрофобных участков макромолекул | Связывание усиливается при высокой концентрации солей | Мягкая очистка белков с сохранением их нативной структуры |
| Проточная флуориметрия | Оптические и флуоресцентные характеристики клеток или частиц | Не является классическим колоночным методом очистки макромолекул | Иммунофенотипирование, подсчет и сортировка клеточных популяций |
Эффективность аффинной хроматографии определяется правильным выбором лиганда, его доступностью на матрице и сохранением обратимости связывания. Метод особенно ценен при выделении целевого белка из сложных биологических смесей, где его концентрация невелика. Чрезмерно жесткие условия элюции могут вызвать денатурацию макромолекулы, поэтому параметры процедуры подбирают с учетом ее устойчивости. Специфическое молекулярное узнавание является главным признаком, отличающим данный подход от других способов хроматографического разделения.