2) первым
3) третьим
4) четвёртым
Правильный ответ — второй этап. В классической схеме гетерогенного иммуноферментного анализа сначала на твёрдой фазе иммобилизируют специфический антиген или антитело, формируя иммунсорбент. На втором этапе свободные участки поверхности блокируют инертным белком, например альбумином или казеином, чтобы предотвратить неспецифическую адсорбцию компонентов образца, после чего вносят анализируемый препарат. Специфический компонент образца связывается с иммобилизированным лигандом, а несвязавшиеся вещества удаляются отмывкой.
Блокирование повышает специфичность и снижает фон реакции, поскольку ограничивает взаимодействие белков с необработанными участками сорбента. После завершения инкубации на твёрдой фазе остаётся только комплекс, образованный в результате специфического иммунного взаимодействия; его количество в дальнейшем выявляют фермент-меченым конъюгатом и субстратом. Поэтому описанная совокупность операций относится не к первичному нанесению иммунореагента и не к последующей ферментной детекции, а именно ко второму этапу.
| Этап | Основная операция | Функциональное значение | Результат |
|---|---|---|---|
| Первый | Иммобилизация антигена или антитела на твёрдой фазе | Формирование специфического иммунсорбента | Лиганд фиксирован на поверхности носителя |
| Второй | Блокирование свободных участков белком и инкубация с анализируемым образцом | Предупреждение неспецифической сорбции и обеспечение специфического связывания | Аналит удержан иммунсорбентом, свободные компоненты удалены отмывкой |
| Третий | Добавление фермент-меченого антитела или антиглобулинового конъюгата | Формирование детектируемого иммунного комплекса | Фермент связан пропорционально количеству определяемого компонента |
| Четвёртый | Внесение хромогенного или флуорогенного субстрата | Преобразование ферментативной метки в измеряемый сигнал | Возникает окрашивание или иной аналитический сигнал |
| Отмывка | Удаление несвязавшихся реагентов между инкубациями | Снижение неспецифического фона | Повышается отношение специфического сигнала к фону |
| Регистрация результата | Фотометрическое, флуориметрическое или хемилюминесцентное измерение | Количественная или качественная оценка реакции | Сигнал сравнивают с калибраторами, контролями или пороговым значением |
Ключевой принцип гетерогенного ИФА заключается в разделении связанной и свободной фракций с помощью твёрдой фазы и последовательных отмывок. Интенсивность конечного сигнала зависит от количества сформированного иммунного комплекса и может быть прямо или обратно пропорциональна концентрации аналита в зависимости от формата анализа. Эффективность блокирования и качество отмывки существенно влияют на воспроизводимость и специфичность результата.