2) коэффициенту растворимости
3) концентрации вещества в растворе (+)
4) молекулярной массе вещества
Согласно закону Бугера–Ламберта–Бера, оптическая плотность (абсорбция) раствора определяется уравнением A = ε·l·c, где A — оптическая плотность, ε — молярный коэффициент поглощения, l — длина оптического пути, c — концентрация поглощающего вещества. При постоянных длине кюветы, длине волны и молярном коэффициенте поглощения увеличение концентрации приводит к пропорциональному увеличению оптической плотности.
Физическая основа зависимости связана с поглощением фотонов молекулами вещества: чем больше число поглощающих частиц на пути светового пучка, тем меньше интенсивность прошедшего излучения. Оптическая плотность рассчитывается как A = −lg T, где T — коэффициент пропускания. Закон наиболее точно выполняется для разбавленных однородных растворов при использовании монохроматического излучения и отсутствии химических взаимодействий, рассеяния света и значительной ионизации аналита.
| Параметр | Обозначение | Влияние на оптическую плотность | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Концентрация поглощающего вещества | c | Прямая пропорциональная зависимость | Используется для количественного определения аналита по калибровочному графику |
| Длина оптического пути | l | Прямая пропорциональная зависимость | При увеличении толщины слоя раствора поглощение возрастает |
| Молярный коэффициент поглощения | ε | Характеризует способность вещества поглощать свет | Зависит от природы вещества, растворителя, длины волны и условий среды |
| Длина волны излучения | λ | Изменяет значение ε, поэтому меняет измеряемую оптическую плотность | Измерения проводят обычно в области максимума поглощения аналита |
| Коэффициент пропускания | T | Связан с оптической плотностью логарифмически: A = −lg T | Чем меньше пропускание, тем выше оптическая плотность |
| Осмоляльность раствора | — | Не входит непосредственно в уравнение закона | Отражает суммарное количество осмотически активных частиц, а не их светопоглощение |
| Молекулярная масса и растворимость | — | Не определяют оптическую плотность напрямую | Могут косвенно влиять на приготовление раствора и пересчёт концентрации, но не заменяют её в уравнении |
В клинико-биохимических исследованиях этот принцип лежит в основе спектрофотометрического определения глюкозы, билирубина, гемоглобина, активности ферментов и других показателей. Концентрацию рассчитывают сравнением оптической плотности образца со стандартом или по калибровочной зависимости. При выходе за линейный диапазон, высокой мутности, гемолизе или изменении химической формы аналита пропорциональность нарушается, поэтому образец может потребовать разведения либо применения другой аналитической методики.