2) иммунохроматографический анализ
3) иммуноферментный анализ
4) полимеразная цепная реакция (+)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты возбудителя. Олигонуклеотидные праймеры — короткие синтетические фрагменты ДНК — комплементарно связываются с участками, фланкирующими диагностически значимую последовательность. Они задают границы амплифицируемого фрагмента и служат начальными точками для термостабильной ДНК-полимеразы.
Каждый цикл ПЦР включает денатурацию двойной цепи ДНК, отжиг праймеров и элонгацию с синтезом новых цепей. Повторение циклов приводит к экспоненциальному накоплению целевого ампликона, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность и позволяет выявлять небольшое количество генетического материала микроорганизма. При исследовании РНК-содержащих вирусов предварительно выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК; такой вариант обозначают ОТ-ПЦР или RT-PCR.
Иммунофлюоресценция, иммунохроматографический и иммуноферментный анализы используют специфическое взаимодействие антигенов и антител, а не праймер-зависимое копирование нуклеиновых кислот. Поэтому именно ПЦР соответствует критерию метода, предполагающего применение олигонуклеотидных праймеров. В режиме реального времени результат регистрируют по флуоресцентному сигналу, возникающему по мере накопления амплифицированного продукта.
| Метод | Исследуемая мишень | Основной реагент | Диагностический результат |
|---|---|---|---|
| ПЦР | ДНК-мишень возбудителя | Олигонуклеотидные праймеры и ДНК-полимераза | Обнаружение специфического ампликона; возможна количественная оценка в real-time формате |
| ОТ-ПЦР | РНК возбудителя после обратной транскрипции | Обратная транскриптаза, праймеры и ДНК-полимераза | Выявление РНК-содержащих вирусов и других РНК-мишеней |
| Иммунофлюоресценция | Антиген микроорганизма в материале | Флуоресцентно меченные антитела | Специфическое свечение исследуемых клеток или частиц |
| Иммунохроматографический анализ | Антиген или антитела | Меченые иммунореагенты и тест-полоска | Визуальная тестовая полоса; быстрый качественный результат |
| Иммуноферментный анализ | Антиген или специфические антитела | Ферментная метка и субстрат | Регистрация окрашивания, обычно фотометрическая |
| Культуральный метод | Жизнеспособный микроорганизм | Питательные среды и условия культивирования | Рост культуры с последующей идентификацией и определением чувствительности |
Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в образце специфической нуклеотидной последовательности, но не всегда подтверждает жизнеспособность возбудителя. Достоверность исследования зависит от правильного забора и транспортировки материала, качества экстракции нуклеиновых кислот и наличия контролей амплификации. Отрицательный результат при низкой концентрации возбудителя или нарушении преаналитического этапа не исключает инфекцию полностью.