2) проходящем видимом свете
3) отраженном УФ-свете
4) темном помещении
Фрагменты ДНК, разделённые электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле и окрашенные этидиумбромидом, выявляют в проходящем ультрафиолетовом свете. Этидиумбромид интеркалирует между парами оснований ДНК, а при возбуждении УФ-излучением его флуоресценция значительно усиливается. Поэтому полосы нуклеиновой кислоты становятся видимыми на фоне геля как оранжево-красные светящиеся зоны.
При исследовании гель размещают на УФ-трансиллюминаторе; излучение проходит через толщу геля, возбуждая связанный с ДНК краситель. Наблюдаемое свечение относится преимущественно к видимому диапазону, однако источником возбуждения является именно проходящий УФ-свет, что отличает метод от освещения в отражённом ультрафиолете или обычном видимом свете. Интенсивность полосы ориентировочно отражает количество ДНК, но зависит также от степени окрашивания, толщины геля и условий регистрации.
| Компонент или этап | Характеристика | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Этидиумбромид | Флуоресцентный интеркалирующий краситель, связывающийся с ДНК | Обеспечивает визуализацию нуклеиновой кислоты после УФ-возбуждения |
| УФ-возбуждение | Обычно используется излучение около 254, 302 или 365 нм; в лабораторной практике часто применяют 302 нм | Запускает флуоресценцию комплекса ДНК — этидиумбромид |
| Направление освещения | УФ-излучение проходит через гель от трансиллюминатора | Позволяет выявлять расположенные внутри геля полосы ДНК |
| Флуоресцентное излучение | Имеет оранжево-красный оттенок и регистрируется в видимом диапазоне | Формирует визуально различимые полосы фрагментов ДНК |
| Положение полосы | Определяется миграцией фрагмента при электрофорезе | Используется для оценки размера фрагмента относительно маркера молекулярной массы |
| Интенсивность свечения | В целом коррелирует с количеством ДНК в полосе | Позволяет ориентировочно оценивать концентрацию материала |
| Альтернативные красители | SYBR Green, SYBR Safe и другие флуоресцентные красители | Могут снижать токсикологические и мутагенные риски по сравнению с этидиумбромидом |
Таким образом, правильным является выявление окрашенных фрагментов в проходящем УФ-свете. Отдельные полосы соответствуют участкам геля с накоплением флуоресцирующего комплекса красителя и ДНК. Для определения размера фрагментов используют ДНК-маркер, нанесённый в соседнюю дорожку. Работа с УФ-излучением и этидиумбромидом требует защиты глаз и кожи, а также соблюдения правил обращения с потенциально мутагенными веществами.