2) мочевину (NH2)2CO (+)
3) глицерин
4) тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)
Мочевина в высокой концентрации, обычно 6–8 моль/л, выполняет роль денатурирующего агента при электрофорезе нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле. Она нарушает водородные связи между комплементарными основаниями и препятствует формированию внутримолекулярных вторичных структур одноцепочечных фрагментов ДНК и РНК. В результате молекулы сохраняют преимущественно развернутую конформацию и мигрируют в электрическом поле главным образом в соответствии с их длиной.
Денатурирующий полиакриламидный электрофорез обладает высокой разрешающей способностью и позволяет различать фрагменты, отличающиеся всего на один нуклеотид. Это особенно важно в молекулярно-генетических исследованиях, включая анализ коротких последовательностей, продуктов секвенирования и аллельных вариантов, применяемых при судебно-экспертной идентификации. Персульфат аммония и ТЕМЕД обеспечивают полимеризацию акриламида, но сами по себе не вызывают денатурацию исследуемых молекул.
| Компонент или условие | Основная функция | Значение для электрофореза |
|---|---|---|
| Мочевина | Разрушение водородных связей | Поддерживает одноцепочечные нуклеиновые кислоты в развернутом состоянии |
| Полиакриламид | Формирование молекулярного сита | Обеспечивает разделение коротких фрагментов с высоким разрешением |
| Персульфат аммония | Инициирование образования свободных радикалов | Запускает полимеризацию акриламида и бисакриламида |
| ТЕМЕД | Ускорение радикальной полимеризации | Катализирует формирование полиакриламидной матрицы |
| Глицерин | Повышение плотности и стабилизация образца | Облегчает внесение материала в лунки, но не является основным денатурантом |
| Неденатурирующий электрофорез | Сохранение пространственной структуры молекул | Миграция зависит не только от длины, но также от формы и конформации |
| Денатурирующий электрофорез | Устранение вторичных структур | Обеспечивает более точное разделение фрагментов преимущественно по размеру |
Применение мочевины уменьшает влияние последовательности нуклеотидов на пространственную конфигурацию исследуемых фрагментов. Для сохранения денатурирующих условий образцы нередко предварительно нагревают, а электрофорез проводят при температуре, препятствующей повторному образованию вторичных структур. Получаемая высокая точность разделения особенно ценна при анализе малых различий между генетическими маркерами. Корректный состав геля непосредственно влияет на воспроизводимость и доказательную значимость результатов молекулярно-генетической экспертизы.