2) лабораторной зоне общего назначения и доступа
3) зоне постановки полимеразной цепной реакции
4) зоне интерпретации результатов экспертизы
Электрофорез относится к этапу постамплификационного анализа: после завершения ПЦР продукты амплификации переносят в специально выделенную зону, где их разделяют в электрическом поле. При агарозном или полиакриламидном электрофорезе фрагменты ДНК мигрируют с различной скоростью в зависимости главным образом от их длины, после чего визуализируются с использованием флуоресцентного красителя и оцениваются относительно маркера молекулярной массы.
Размещение этой процедуры в зоне анализа продуктов амплификации имеет принципиальное санитарно-противоэпидемическое значение для лаборатории. Ампликоны присутствуют в высокой концентрации и могут загрязнить рабочие поверхности, оборудование, реагенты и образцы, вызывая ложноположительные результаты последующих ПЦР. Поэтому поток материалов организуют однонаправленно — от чистых преамплификационных помещений к постамплификационной зоне; возврат посуды, средств защиты и оборудования обратно не допускается. Зона интерпретации предназначена для оценки уже полученных данных, а не для выполнения электрофоретического разделения.
| Этап работы | Основные операции | Статус зоны | Ключевой риск или критерий контроля |
|---|---|---|---|
| Приём и первичная подготовка материала | Регистрация, идентификация, выделение ДНК | Преамплификационная зона | Предотвращение перекрёстной контаминации исходными образцами |
| Подготовка реакционной смеси | Дозирование праймеров, дезоксинуклеотидов, буфера и ДНК-полимеразы | Чистая лабораторная зона | Контроль отрицательных проб и стерильности расходных материалов |
| Постановка ПЦР | Внесение матрицы и проведение циклов денатурации, отжига и элонгации | Зона амплификации | Соблюдение температурно-временного профиля и герметичности пробирок |
| Электрофоретическое разделение | Нанесение ампликонов в лунки геля, миграция в электрическом поле, визуализация полос | Зона анализа продуктов амплификации | Работа с концентрированными ампликонами; исключение их переноса в чистые зоны |
| Оценка электрофореграммы | Сопоставление полос с маркером длины и контрольными образцами | Постамплификационный этап | Учитываются размер фрагмента, наличие контролей и отсутствие неспецифических полос |
| Интерпретация экспертных результатов | Формулировка вывода с учётом аналитических и клинических либо судебно-экспертных данных | Зона обработки и интерпретации данных | Не подменяет лабораторную процедуру разделения и визуализации ДНК |
Электрофореграмма считается аналитически достоверной только при корректном прохождении положительного и отрицательного контролей, а также при соответствии полос ожидаемым размерам. Для судебно-генетических исследований дополнительно оценивают профиль исследуемого объекта, сопоставимость аллельных вариантов и возможность артефактов амплификации. Соблюдение зонирования снижает вероятность ампликонной контаминации и ложноположительных заключений. Таким образом, правильный ответ определяется тем, что электрофорез является процедурой непосредственного анализа продуктов завершённой ПЦР.