2) аллельный маркер (лэддер), агарозный гель, бромистый этидий
3) праймеры, трифосфаты, ДНК-полимераза, буфер, ионы Mg2, ДНК-матрица (+)
4) акриламидный гель, бромистый этидий, изопропанол
Правильный ответ включает базовый состав реакционной смеси для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР): праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, термостабильную ДНК-полимеразу, буфер, ионы магния и ДНК-матрицу. Праймеры комплементарно связываются с фланкирующими участками исследуемой последовательности и задают границы амплифицируемого фрагмента. ДНК-матрица содержит целевой участок, который многократно копируется в ходе реакции.
ПЦР состоит из повторяющихся циклов денатурации ДНК, отжига праймеров и элонгации цепи. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты служат субстратами для синтеза новых цепей, а термостабильная ДНК-полимераза сохраняет активность при многократном нагревании, что особенно важно для использования ферментов типа Taq-полимеразы. Ионы Mg2+ необходимы для каталитической активности фермента и взаимодействия с фосфатными группами нуклеотидов, тогда как буфер поддерживает оптимальные pH и ионную силу среды.
Агарозный или акриламидный гель, электрофоретический маркер, бромистый этидий и флуоресцентные красители относятся преимущественно к этапу визуализации и анализа продуктов амплификации, а не к обязательным компонентам самой ПЦР. Лаурилсульфат натрия и изопропанол могут использоваться при отдельных процедурах выделения или обработки нуклеиновых кислот, но не обеспечивают протекание амплификационного цикла.
| Компонент или материал | Роль в исследовании | Значение для ПЦР |
|---|---|---|
| ДНК-матрица | Источник целевой нуклеотидной последовательности | Содержит участок, подлежащий копированию; при анализе РНК предварительно получают кДНК |
| Праймеры | Короткие олигонуклеотиды, комплементарные фланкирующим участкам мишени | Определяют специфичность и границы ампликона, предоставляют 3′-гидроксильный конец для синтеза |
| Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты | Мономеры для построения новых цепей ДНК | Расходуются в процессе элонгации и обеспечивают накопление амплифицированного продукта |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Фермент, катализирующий присоединение нуклеотидов | Работает после циклов денатурации; наиболее известный вариант — Taq-полимераза |
| Ионы Mg2+ | Кофактор ДНК-полимеразы | Необходимы для катализа; их концентрация влияет на выход и специфичность реакции |
| Буферный раствор | Поддерживает стабильные химические условия реакции | Обеспечивает оптимальные pH и ионную силу для работы полимеразы и праймеров |
| Агарозный гель, лэддер, красители | Разделение, визуализация и оценка длины продуктов | Используются после амплификации и не являются обязательными ингредиентами реакционной смеси |
Результатом ПЦР является экспоненциальное накопление фрагмента ДНК, расположенного между праймерами. Специфичность анализа определяется прежде всего последовательностью праймеров, температурой отжига и концентрацией магния. Для интерпретации результата дополнительно применяют положительный и отрицательный контроли, позволяющие выявить отсутствие амплификации или контаминацию.