2) помещение для приготовления реагентов, компонентов реакционных смесей (+)
3) помещение для проведения электрофореза ДНК
4) помещения для приема, регистрации, хранения и подготовки вещественных доказательств
Лабораторная чистая зона ПЦР относится к дополимерационному этапу исследования и предназначена для приготовления реагентов, мастер-миксов и других компонентов реакционных смесей до внесения исследуемой ДНК. В этой зоне не должны находиться образцы, выделенная матричная ДНК и продукты амплификации. Основная задача такого разделения — исключить попадание чужеродного генетического материала в реакцию, поскольку даже минимальное количество ампликона может привести к ложноположительному результату.
Для чистой зоны используют отдельное оборудование, расходные материалы и средства индивидуальной защиты; применяют аэрозольные наконечники, регламентированную дезинфекцию и, при необходимости, ультрафиолетовую обработку поверхностей. Организация помещений строится по принципу однонаправленного движения материала и персонала: от чистых операций к зонам работы с образцами, а затем к амплификации и анализу продуктов ПЦР. Помещение для электрофореза относится к постамплификационной, потенциально контаминированной зоне, тогда как прием и подготовка вещественных доказательств, а также взятие биологических образцов выполняются вне чистой зоны приготовления реагентов.
| Зона или этап | Основная функция | Допустимый генетический материал | Риск контаминации |
|---|---|---|---|
| Приготовление реагентов и реакционных смесей | Дозирование компонентов, подготовка мастер-миксов, постановка отрицательных контролей | Реагенты без матричной ДНК и ампликонов | Минимальный при соблюдении правил чистой зоны |
| Подготовка и выделение ДНК из образцов | Лизис материала, экстракция и очистка нуклеиновых кислот | Исследуемые образцы и выделенная ДНК | Выше; возможно взаимное загрязнение образцов |
| Внесение матрицы в реакционную смесь | Добавление ДНК образца и контрольных материалов в подготовленный мастер-микс | Матричная ДНК, положительные и отрицательные контроли | Умеренный; требуется физическое или процедурное разделение |
| Амплификация | Проведение циклов температурной денатурации, отжига праймеров и элонгации | Реакционные смеси в закрытых пробирках | Связан с возможным нарушением герметичности |
| Электрофорез и анализ продуктов ПЦР | Разделение и визуализация ампликонов | Высокие концентрации продуктов амплификации | Высокий; ампликоны являются основным источником ложноположительной контаминации |
| Прием, регистрация и хранение вещественных доказательств | Обеспечение сохранности объектов и прослеживаемости их движения | Исходные вещественные доказательства | Зависит от характера объектов; зона не является чистой зоной ПЦР |
| Взятие биологических образцов | Получение материала от объекта исследования с оформлением документации | Первичный биологический материал | Риск заноса посторонней ДНК и перекрестного загрязнения |
Таким образом, правильный ответ определяется функциональным назначением чистой зоны — подготовкой всех компонентов реакции до контакта с матрицей и амплифицированной ДНК. Разделение помещений обеспечивает достоверность судебно-медицинского и судебно-генетического исследования. Особое значение имеет контроль отрицательных проб: их загрязнение указывает на возможную контаминацию реагентов, оборудования или рабочей зоны. Результаты ПЦР должны интерпретироваться с учетом соблюдения зонирования, лабораторной трассируемости и процедур внутреннего контроля качества.