2) протеиназу К
3) ДНК (матрицу), ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозиды, праймеры (+)
4) ДТТ
Ключевыми компонентами классической полимеразной цепной реакции являются ДНК-матрица, термостабильная ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты и два праймера, комплементарных участкам, ограничивающим амплифицируемую последовательность. Праймеры задают границы целевого фрагмента, а полимераза в присутствии дНТФ синтезирует новые цепи ДНК в направлении 5′→3′. Многократное повторение стадий денатурации, отжига праймеров и элонгации приводит к экспоненциальному накоплению ампликона.
Именно поэтому правильным является вариант, объединяющий матричную ДНК, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозиды и праймеры. Для работы фермента также необходимы оптимизированный буфер и ионы магния, однако они не перечислены в данном варианте. В судебно-генетической практике этот принцип используют для амплификации STR-локусов, митохондриальной ДНК и других участков генома при идентификации личности и установлении биологического родства.
Протеиназа K относится преимущественно к этапу выделения нуклеиновых кислот: она расщепляет белки и способствует высвобождению ДНК из биологического материала. Дитиотреитол (ДТТ) является восстановителем и применяется для разрушения дисульфидных связей, например при подготовке некоторых сложных образцов. Трис входит в состав реакционного буфера, но сам по себе, особенно в виде высококонцентрированного 1 М раствора, не обеспечивает протекание амплификации и может нарушить оптимальные условия реакции.
| Компонент | Функция в ПЦР | Последствия отсутствия или нарушения концентрации | Значение для судебно-генетического исследования |
|---|---|---|---|
| ДНК-матрица | Содержит участок, который должен быть амплифицирован | Отсутствие сигнала; при деградации возможен неполный профиль | Источник — кровь, слюна, эпителий, волосы и другие биологические объекты |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Катализирует синтез новых цепей ДНК после каждого цикла нагревания | Амплификация не происходит или резко снижается | Обычно применяют Taq-полимеразу и её модификации |
| Дезоксинуклеозидтрифосфаты | Являются субстратами для построения дочерних цепей ДНК | Остановка синтеза либо образование неспецифических продуктов при нарушении соотношения | Необходимы для точного копирования целевой последовательности |
| Праймеры | Комплементарно связываются с матрицей и задают границы ампликона | Нет специфического продукта; возможны неспецифические ампликоны при неправильном дизайне | Определяют исследуемый STR-локус или иной генетический маркер |
| Буфер и ионы Mg2+ | Поддерживают оптимальные pH и ионные условия работы полимеразы | Снижение выхода, неспецифическая амплификация или ингибирование реакции | Состав и концентрация критичны при анализе малых и ингибированных образцов |
| Протеиназа K | Разрушает белки на этапе подготовки образца | Недостаточная очистка ДНК, но не прямое прекращение уже подготовленной ПЦР | Используется до реакции, особенно при работе с тканями и клеточным материалом |
| ДТТ | Восстанавливает дисульфидные связи и облегчает лизис отдельных образцов | Может быть избыточным или мешать реакции при переносе в реакционную смесь | Применяется как вспомогательный реагент при экстракции, а не как обязательный компонент ПЦР |
Для амплификации РНК предварительно требуется стадия обратной транскрипции с образованием кДНК; это уже формат ОТ-ПЦР. Надёжность результата оценивают с использованием положительного, отрицательного и контрольного образцов, а также контролей экстракции. В судебной генетике особое значение имеют предотвращение контаминации, разделение зон работы и подтверждение воспроизводимости профиля. Следовательно, вспомогательные реагенты подготовки образца нельзя приравнивать к обязательным субстратам и ферментам самой ПЦР.