2) гематин
3) меланин
4) коллаген (+)
Коллаген является основным структурным белком соединительной ткани и в значительном количестве присутствует в коже, фасциях, рубцовой ткани и других мягких тканях. При недостаточном протеолизе и очистке он либо его фрагменты могут совместно выделяться с ДНК. Остаточные белковые компоненты матрикса снижают доступность матрицы для праймеров и могут подавлять активность термостабильной ДНК-полимеразы, что приводит к уменьшению эффективности амплификации.
Ингибирование проявляется увеличением значения порогового цикла в количественной ПЦР, снижением интенсивности ампликонов, неполнопрофильной амплификацией и выпадением аллелей при исследовании STR-маркеров. Особенно важно это для судебно-генетических объектов с малым количеством или деградированной ДНК: ингибитор может создать картину ложного дефицита генетического материала. Наличие ингибирования оценивают по внутреннему контрольному ампликону, сравнением результатов до и после разведения экстракта либо повторной очистки.
Остальные перечисляемые соединения также способны подавлять ПЦР, но обычно связаны с иными видами биологического или внешнего загрязнения. Гематин характерен прежде всего для крови, гумусовые кислоты — для почвы и растительного материала, а меланин — для пигментированных тканей и волос. Поэтому для ДНК, выделенной из мягких тканей, наиболее специфичным источником ингибирования в рамках данного задания является коллаген.
| Ингибирующий компонент | Типичный источник | Основное влияние на ПЦР | Признак в лабораторном исследовании |
|---|---|---|---|
| Коллаген и продукты его неполного расщепления | Соединительная ткань, кожа, фасции, рубцовые и плотные мягкие ткани | Снижение активности ДНК-полимеразы, ухудшение доступности матрицы и праймеров | Слабая или неполная амплификация, выпадение аллелей, увеличение значения Cq |
| Гематин и другие компоненты гема | Кровь и кровяные примеси | Нарушение работы полимеразы и взаимодействия фермента с матрицей ДНК | Снижение сигнала внутреннего контроля, вплоть до полного отсутствия амплификации |
| Гумусовые кислоты | Почва, растительные и экологические образцы | Связывание с ДНК и полимеразой, изменение доступности ионных компонентов реакции | Выраженное подавление ПЦР в образцах с почвенным загрязнением |
| Меланин | Пигментированные кожа и волосы | Неспецифическое связывание с нуклеиновыми кислотами и ферментом | Низкая эффективность амплификации при анализе пигментированного материала |
| Остаточный этанол, гуанидиниевые соли и другие реагенты | Недостаточно промытые экстракты после выделения ДНК | Денатурация или функциональное подавление полимеразы, нарушение состава реакционной смеси | Воспроизводимое ингибирование, уменьшающееся после дополнительной очистки или разведения |
| Внутренний контроль амплификации | Контрольная ДНК или контрольный ампликон, добавленный в реакцию | Позволяет отличить истинное отсутствие мишени от подавления реакции | Отсутствие или задержка контрольного сигнала указывает на ингибирование |
Для уменьшения влияния коллагена применяют эффективный протеолиз с протеиназой K, достаточную лизисную обработку и тщательную очистку экстракта. Дополнительными приемами служат повторное выделение ДНК, разведение образца и, в некоторых протоколах, добавление белка-стабилизатора BSA. В судебно-генетической практике результат считают надежным только при наличии валидного внутреннего контроля и воспроизводимой амплификации исследуемых локусов.