2) флуориметрией
3) методом ПЦР в реальном времени
4) с помощью электрофореза
Жидкостная хроматография не относится к стандартным методам количественной оценки экстрагированной ДНК в судебно-генетическом исследовании. Ее основной принцип заключается в разделении компонентов смеси по различиям их взаимодействия с неподвижной и подвижной фазами. Хотя хроматографические методы могут применяться для анализа и очистки нуклеиновых кислот, они не обеспечивают принятую в судебной генетике прямую оценку концентрации пригодной для последующей амплификации ДНК без специальной системы детектирования и калибровки.
Для количественного определения ДНК используют методы, сигнал которых непосредственно связан с количеством нуклеиновой кислоты. Флуориметрия основана на связывании специфического флуоресцентного красителя с ДНК и измерении интенсивности флуоресценции. ПЦР в реальном времени позволяет определить количество амплифицируемой, в том числе человеческой, ДНК по пороговому циклу реакции и калибровочной зависимости; этот подход особенно важен в судебно-генетической практике, поскольку одновременно дает представление о пригодности материала для STR-типирования. Электрофорез может использоваться для ориентировочной или полуколичественной оценки по интенсивности полос или пиков относительно стандартов известной концентрации.
Выбор метода количественной оценки имеет практическое значение для нормализации количества матричной ДНК перед ПЦР. Недостаток ДНК повышает риск выпадения аллелей и появления неполного генетического профиля, тогда как избыток матрицы способен приводить к дисбалансу пиков и другим артефактам электрофоретического профиля. Поэтому наиболее информативным методом перед судебно-генетическим STR-анализом считается количественная ПЦР, позволяющая оценивать именно амплифицируемую человеческую ДНК.
| Метод | Принцип | Возможность оценки количества ДНК | Основное ограничение |
|---|---|---|---|
| Жидкостная хроматография | Разделение компонентов смеси по физико-химическим свойствам | Не используется как стандартный самостоятельный метод количественной оценки экстрагированной ДНК | Необходимы специальный детектор, стандарты и аналитическая методика; результат не отражает непосредственно амплифицируемую человеческую ДНК |
| Флуориметрия | Флуоресценция красителя после связывания с нуклеиновой кислотой | Количественная | В зависимости от реагента может не различать человеческую и постороннюю ДНК |
| ПЦР в реальном времени | Регистрация накопления продукта амплификации по флуоресцентному сигналу | Высокоточная количественная | Требует специфических праймеров, стандартов и контролируемых условий реакции |
| Электрофорез в агарозном геле | Разделение фрагментов ДНК в электрическом поле | Ориентировочная, полуколичественная | Ниже чувствительность и точность по сравнению с флуориметрией и qPCR |
| Капиллярный электрофорез | Разделение меченых фрагментов с регистрацией флуоресценции | Позволяет сравнительно оценивать количество продуктов амплификации | Обычно применяется после ПЦР, а не для первичной квантификации экстракта |
| Спектрофотометрия | Измерение поглощения ультрафиолета, преимущественно при 260 нм | Количественная оценка общей концентрации нуклеиновых кислот | Низкая специфичность; примеси и РНК могут искажать результат |
В судебной молекулярной генетике важно различать измерение общей концентрации нуклеиновых кислот и определение количества ДНК, реально пригодной для амплификации. qPCR дает дополнительную информацию о наличии ингибиторов, деградации материала и соотношении различных мишеней, если это предусмотрено используемым набором. Такие данные помогают выбрать оптимальное количество экстракта для STR-амплификации и снизить вероятность получения неполного либо артефактного генетического профиля. Жидкостная хроматография решает преимущественно задачи разделения и аналитического контроля компонентов, поэтому не является стандартным методом квантификации ДНК в данном контексте.