2) накопление копий определенной нуклеотидной последовательности во время полимеразной цепной реакции
3) фрагментацию ДНК под воздействием различных деструктивных факторов (+)
4) соединение комплементарных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот в одну двухцепочечную молекулу
Деградация ДНК представляет собой разрушение молекулы с образованием фрагментов меньшей длины под действием биологических, химических и физических факторов. Основой процесса является разрыв фосфодиэфирных связей в сахарофосфатном остове ДНК. Разрушение вызывают нуклеазы, микроорганизмы, гидролиз, окисление, ультрафиолетовое излучение, повышенная температура, влага и длительное хранение биологического материала.
В судебно-генетическом исследовании деградация снижает вероятность успешного анализа длинных участков ДНК. При исследовании STR-маркеров это проявляется преимущественным выявлением коротких ампликонов, выпадением отдельных аллелей, дисбалансом пиков в электрофореграмме и формированием неполного генетического профиля. Степень разрушения оценивают, в частности, количественной ПЦР с сопоставлением сигналов короткой и длинной мишени; выраженное снижение представительства длинного фрагмента указывает на деградацию матрицы.
Деградацию необходимо отличать от денатурации, при которой две цепи ДНК обратимо разделяются вследствие разрушения водородных связей без разрыва фосфодиэфирного остова. Гибридизация, напротив, означает соединение комплементарных одноцепочечных молекул, а амплификация при ПЦР — многократное копирование целевого участка. Эти процессы изменяют состояние или количество нуклеиновой кислоты, но сами по себе не означают ее разрушения.
| Процесс или форма повреждения | Основной механизм | Молекулярный результат | Значение для судебно-генетического анализа |
|---|---|---|---|
| Деградация ДНК | Разрыв фосфодиэфирных связей и химическое повреждение оснований | Укорочение фрагментов, появление поврежденных матриц | Неполный профиль, выпадение аллелей, снижение качества генотипирования |
| Ферментативная деградация | Действие эндонуклеаз и экзонуклеаз, в том числе микробного происхождения | Расщепление ДНК внутри цепи или последовательное удаление нуклеотидов с конца | Особенно характерна для влажных и биологически загрязненных образцов |
| Неферментативная деградация | Гидролиз, окисление, воздействие тепла и ультрафиолета | Фрагментация и модификация азотистых оснований | Возникает при неблагоприятном хранении, инсоляции и длительном воздействии окружающей среды |
| Денатурация | Разрыв водородных связей между комплементарными цепями | Разделение двухцепочечной ДНК на две одноцепочечные молекулы без обязательного разрушения остова | Используется как обратимый этап ПЦР и не является деградацией |
| Гибридизация | Комплементарное спаривание одноцепочечных нуклеиновых кислот | Формирование двухцепочечного участка | Лежит в основе связывания праймеров и зондов, но не отражает разрушение ДНК |
| Амплификация при ПЦР | Циклическая репликация выбранного участка с участием праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы | Экспоненциальное увеличение числа копий мишени | Позволяет работать с малыми количествами ДНК, но не устраняет исходную фрагментацию матрицы |
| Признаки выраженной деградации | Преимущественное сохранение коротких фрагментов | Снижение амплификации длинных мишеней и неравномерный профиль | Обосновывает применение короткоампликонных STR-систем, митохондриального анализа или SNP-панелей |
Для предупреждения деградации образцы необходимо быстро высушивать, защищать от ультрафиолета и хранить при пониженной температуре в условиях, препятствующих микробному росту. При работе с разрушенной ДНК выбирают методы, ориентированные на короткие ампликоны, и обязательно учитывают возможные ингибиторы ПЦР. Результаты интерпретируют с учетом вероятности выпадения аллелей и статистической неполноты профиля. Таким образом, деградация является фактором, непосредственно ограничивающим надежность идентификационного генетического исследования.