2) соединение одноцепочечных комплементарных молекул нуклеиновых кислот в одну двухцепочечную молекулу
3) определение последовательности нуклеотидов в определенных участках молекулы ДНК
4) методику разделения, очистки и детекции молекул, основанную на различии скорости их движения под воздействием электрического поля
Дифференциальный лизис — это этап молекулярно-генетического исследования смешанного биологического следа, прежде всего при наличии спермы и эпителиальных клеток. Сначала проводят щадящий лизис некапсулозных клеток с использованием детергентов и протеиназы K, тогда как сперматозоиды сохраняются в осадке благодаря плотной упаковке хроматина протаминами и дисульфидными связями. После центрифугирования получают отдельную нес-пермальную фракцию и осадок, обогащённый сперматозоидами.
Затем к сперматозоидной фракции добавляют дитиотреитол (DTT), который восстанавливает дисульфидные связи ядерных белков, облегчая разрушение головок сперматозоидов и последующее выделение мужской ДНК. Раздельное исследование фракций позволяет сопоставить аутосомный STR-профиль эпителиального компонента с профилем сперматозоидного компонента и повысить информативность экспертизы смешанных следов. Именно последовательное разделение клеточных популяций в процессе выделения ДНК характеризует правильный ответ.
| Метод или фракция | Основной принцип | Экспертное значение |
|---|---|---|
| Дифференциальный лизис | Последовательное разрушение сначала эпителиальных, затем сперматозоидных клеток с разделением лизатов | Получение относительно обособленных женской и мужской ДНК-фракций из смешанного следа |
| Неспрматозоидная фракция | Супернатант после щадящего лизиса и центрифугирования | Содержит ДНК эпителиальных и других легко лизируемых клеток; обычно используется для аутосомного профилирования |
| Сперматозоидная фракция | Осадок, дополнительно обработанный DTT, протеиназой K и детергентом | Обогащена мужской ДНК; применяется для получения STR- или Y-STR-профиля |
| Тотальный лизис | Одновременное разрушение всех клеток без предварительного разделения | Может привести к выраженному смешанному профилю и затруднить интерпретацию мужского компонента |
| Электрофорез | Разделение молекул по скорости миграции в электрическом поле с учётом размера и заряда | Метод анализа или визуализации нуклеиновых кислот, но не способ селективного разделения сперматозоидов и эпителиальных клеток |
| Гибридизация | Комплементарное спаривание одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот | Используется для обнаружения комплементарных последовательностей и не описывает дифференциальное выделение клеток |
| Секвенирование | Установление последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК | Характеризует структуру ДНК после её выделения, но не является методом клеточного лизиса |
Качество разделения зависит от соотношения клеточных компонентов, сохранности сперматозоидов и полноты переноса фракций. При малом количестве сперматозоидов, их деградации или неполном лизисе возможно получение слабого либо смешанного генетического профиля. Результаты оценивают с учётом контрольных образцов, маркеров загрязнения и особенностей используемой STR-системы. Дифференциальный лизис является подготовительным этапом, а идентификационное значение имеет последующее генотипирование выделенной ДНК.