2) РНК-полимеразы
3) термостабильной ДНК-полимеразы (+)
4) протеиназы
Ключевым условием практического применения полимеразной цепной реакции стало использование термостабильной ДНК-полимеразы, прежде всего Taq-полимеразы, выделенной из бактерии Thermus aquaticus. Этот фермент сохраняет активность после многократного нагревания реакционной смеси до температуры денатурации ДНК, поэтому его не требуется добавлять заново после каждого цикла. Обычные ДНК-полимеразы при таких температурах инактивируются, что делает автоматическое многократное копирование заданного участка генома практически невозможным.
Механизм ПЦР основан на повторяющихся циклах: разделении двух цепей ДНК при нагревании, присоединении специфических праймеров к комплементарным последовательностям при охлаждении и синтезе новых цепей термостабильной полимеразой. Каждый цикл примерно удваивает количество целевого фрагмента, поэтому за ัด десятки циклов формируется экспоненциальное накопление ампликона. Специфичность реакции определяется последовательностью праймеров, а наличие продукта может оцениваться электрофорезом или в режиме реального времени по флуоресценции.
Рестриктазы расщепляют ДНК в определённых участках и используются для анализа фрагментов, но не обеспечивают их многократное копирование. РНК-полимеразы синтезируют РНК, а протеиназы расщепляют белки; ни один из этих ферментов не выполняет термостабильный синтез комплементарной цепи ДНК. В судебно-медицинской практике ПЦР позволяет исследовать малые количества или частично деградировавшую ДНК, амплифицируя локусы STR, после чего генетический профиль анализируют, например, методом капиллярного электрофореза.
| Этап или компонент ПЦР | Основное условие | Происходящий процесс | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Денатурация | Высокая температура, обычно около 94–98 °C | Разрыв водородных связей и разделение двух цепей ДНК | Открывает матрицу для последующего копирования |
| Отжиг праймеров | Снижение температуры до уровня, соответствующего составу праймеров | Комплементарное связывание праймеров с матричной ДНК | Определяет границы и специфичность амплифицируемого фрагмента |
| Элонгация | Оптимальная температура действия выбранной ДНК-полимеразы, для Taq обычно около 72 °C | Синтез новой цепи в направлении 5′→3′ | Формирует копию целевого участка |
| Повторение циклов | Обычно 25–40 циклов | Последовательное удвоение количества ампликона | Обеспечивает высокую аналитическую чувствительность метода |
| ПЦР в реальном времени | Регистрация флуоресценции после каждого цикла | Измерение накопления продукта по сигналу флуоресцентного красителя или зонда | Позволяет количественно оценивать исходное количество нуклеиновой кислоты |
| Контроль реакции | Отрицательный контроль, положительный контроль и контроль экстракции | Проверка загрязнения, работоспособности реагентов и качества выделения ДНК | Необходим для достоверной интерпретации судебно-генетического результата |
Термостабильная ДНК-полимераза превратила ПЦР из экспериментально трудоёмкой процедуры в воспроизводимый автоматизированный метод. Для судебной экспертизы особенно важны высокая чувствительность, возможность типирования ограниченного биологического материала и строгий контроль контаминации. При интерпретации результата учитывают качество исходной ДНК, наличие ингибиторов, профиль амплификации и соответствие положительным и отрицательным контролям. Современные ферменты с повышенной точностью копирования применяют, когда требуется минимизировать риск внесения полимеразных ошибок.