2) контроля чистоты выделения ДНК
3) устранения ингибиторов ПЦР
4) контроля адекватности спектральной калибровки генетического анализатора
Положительный контроль представляет собой образец ДНК с заранее установленным генотипом, содержащий известные аллели исследуемых локусов. Его одновременное включение в ПЦР позволяет убедиться, что праймеры, реакционная смесь, температурный режим и оборудование обеспечивают амплификацию целевых фрагментов. После разделения ампликонов методом капиллярного электрофореза полученный профиль сопоставляют с ожидаемым: совпадение размеров и относительной интенсивности пиков подтверждает корректность работы тест-системы.
В генетическом анализе положительный контроль также используется для проверки правильности интерпретации аллелей при сравнении образца с аллельным лэддером — эталонным набором фрагментов известного размера. Наличие ожидаемых пиков в положительном контроле свидетельствует о том, что амплификация прошла специфично в пределах валидированной системы, а идентификация аллелей и их номенклатура применяются корректно. Поэтому именно этот контроль соответствует указанной цели.
Положительный контроль не предназначен для оценки чистоты выделения ДНК: для этого используют контроль экстракции. Наличие ингибиторов выявляют с помощью внутреннего амплификационного контроля или сопоставления результатов контрольных реакций. Спектральную калибровку генетического анализатора проверяют специальными калибровочными стандартами, а не контрольной ДНК.
| Компонент контроля | Материал | Основная задача | Критерий приемлемости |
|---|---|---|---|
| Положительный контроль | ДНК с известным генотипом | Проверка работы ПЦР, праймеров и корректности определения ожидаемых аллелей | Получен профиль, соответствующий установленному генотипу |
| Отрицательный контроль ПЦР | Реакционная смесь без матричной ДНК | Выявление контаминации реагентов или рабочего пространства | Отсутствуют специфические амплификационные пики |
| Контроль экстракции | Проба, прошедшая все этапы выделения без биологического материала | Контроль загрязнения на этапе экстракции ДНК | Специфический продукт амплификации отсутствует |
| Внутренний амплификационный контроль | Другая контрольная мишень или экзогенная ДНК | Оценка наличия ингибиторов и пригодности реакции к амплификации | Контрольный сигнал сохраняется в пределах валидированных значений |
| Аллельный лэддер | Набор фрагментов с известными аллелями и размерами | Идентификация и номенклатура аллелей исследуемого локуса | Пики образца корректно сопоставляются с эталонными аллелями |
| Внутренний стандарт размера | Фрагменты ДНК с известными размерами, меченные флуорофором | Расчёт размеров ампликонов при капиллярном электрофорезе | Стандартные пики распознаются программой в заданном диапазоне |
| Спектральный калибровочный стандарт | Флуоресцентный калибровочный материал | Настройка разделения сигналов различных флуорофоров анализатором | Калибровочные параметры соответствуют требованиям метода |
Таким образом, положительный контроль является индикатором работоспособности всей аналитической цепочки от амплификации до распознавания генетического профиля. Его результат должен оцениваться совместно с отрицательными контролями, внутренним стандартом размера и аллельным лэддером. Отклонение контрольного профиля делает результаты серии недостоверными или требующими повторного исследования. Разные виды контроля решают разные задачи и не могут взаимозаменять друг друга.